Charakterisierung neuer Interaktionspartner von Kerntransportfaktoren in Sacharomyces cerevisiae

Abstract

Mit dem Zwei-Hybrid System wurden neue Interaktionspartner für das Importin Kap114 identifiziert. Darunter waren die Histon-Methyltransferase Set2, Sda1, das mRNA-Export- Adapterprotein Yra1 sowie Nis1 und die Proteinkinase Hsl1, die beide in die Regulation der Mitose involviert sind. Die nähere Charakterisierung von Yra1 identifizierte ein zweites, C-terminales Kernimportsignal, an das Kap114 und Nmd5 bevorzugt binden, während Pse1 das Nterminale NLS präferiert. Mittels Lokalisierungsstudien wurde nachgewiesen, dass Yra1 Gsp1-abhängig über die Importine Pse1 und Kap123 in den Kern transportiert wird. Nmd5 und Kap114 scheinen Nebenwege zu vermitteln. Der detektierte trimere Komplex von Yra1 und Nap1 mit Kap114 bzw. Pse1 weist auf einen möglichen Coimport von Nap1 und Yra1 hin. Hsl1 wurde, abhängig von seiner Septinbindungsdomäne, an der Sprossungszone einer sich teilenden Hefezelle ("bud neck") lokalisiert. Es wurde nachgewiesen, dass der N-Terminus von Hsl1, der die Kinasefunktion trägt, eine NLS besitzt, Gsp1-abhängig in den Nukleus importiert wird und Pse1 und Kap123 in diesen Import involviert sind. Auch Hsl1 bildet trimere Komplexe mit Kap114 bzw. Pse1 und Nap1, was auf einen Coimport, aber auch auf eine mögliche Chaperonfunktion der Kerntransportfaktoren und Nap1 hinweist. Über Deletionsmutanten wurde gezeigt, dass Kap114 in der mitotischen Signalkaskade des Morphogenese-Kontrollpunktes agiert, die in der Hemmung von Swe1 mündet, und zwar auf der gleichen Ebene wie Nap1.

Several new interaction partners for the nuclear import receptor Kap114 were identified by two-hybrid screening. Among these were the histone methyltransferase Set2, Sda1, the mRNA export adapter protein Yra1 as well as Nis1 and Hsl1, both involved in the regulation of mitosis. The characterization of Yra1 showed the presence of a second C-terminal NLS, which is the primary binding site for the importins Kap114 and Nmd5, whereas Pse1 prefers the Nterminal NLS. Using localization studies, it was demonstrated that the nuclear import of Yra1 is Gsp1-dependent and occurs via Pse1 and Kap123. Nmd5 and Kap114 seem to mediate backup pathways. The detected trimeric complex of Yra1 with Nap1 and Kap114 or Pse1 suggests a possible coimport of Yra1 and Nap1. The localization of Hsl1 at the bud neck of a dividing yeast cell depends on its septin binding domain. It was shown that the N-terminus of Hsl1 containing the kinase function exhibits a NLS, is transported into the nucleus in a Gsp1-dependent fashion, and Kap114 and Pse1 are involved in this import. Like Yra1, Hsl1 is able to form trimeric complexes with Nap1 and Kap114 or Pse1, which hints to a coimport or a potential chaperone activity of the nuclear transport factors and Nap1. A deletion mutant analysis shows a function of Kap114 in the mitotic signaling cascade of the morphogenetic checkpoint, which leads to the inactivation of Swe1. Furthermore, Kap114 and Nap1 act on the same level of regulation in this pathway.