Multifunktionalisierte magnetische Nanopartikel als Drug-Delivery Systeme

Abstract

Der Schwerpunkt dieser Dissertation ist die Synthese von multifunktionalen, magnetischen Nanopartikelen für biomedizinische Anwendungen. Hierbei werden die Nanopartikel der Stöchiometrie Mn0,8Zn0,2Fe2O4 durch kontrollierte Fällung der entsprechenden Metallchloride in Natronlauge synthetisiert. Anschließend wird deren Oberfläche durch verschiedene Verfahren mit ausgewählten biokompatiblen Polymeren beschichtet und mit Doxorubicin, einem Chemotherapeutikum, funktionalisiert. Daran anschließend wird das Potential dieser Doxorubicin-funktionalisierten magnetischen Nanopartikel in-vitro für den Einsatz in der adoptiven Krebsimmuntherapie getestet. Als erstes wird Dextran zur Oberflächenmodifizierung der MnZn-Ferrite verwendet. Durch entsprechende Funktionalisierung mittels Aldehyd-, Carboxymethyl- oder Amino-Gruppen kann Dextran aktiviert und Doxorubicin angebunden werden. Die erfolgreiche Anbindung Doxorubicins an die beschichteten Partikel wird mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS), Fluoreszenz-Korrelations-, Raman-, FT-IR-, UV/Vis- und Fluoreszenz-Spektroskopie, sowie Zetapotential-Messungen nachgewiesen. Die anschließende Aufnahme der wirkstoffbeladenen Partikeln in die Immunzellen (T-Lymphozyten) wird mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie und TEM-Aufnahmen nachgewiesen. Die Aktivität dieser Wirkstoff-funktionalisierten Partikel auf Krebszellen wird mit Hilfe von SRB- und MTT-Assays nachgewiesen. Die Layer-by-Layer-Technik (LbL-Technik) stellt ein weiteres Verfahren dar, welches zur Oberflächenmodifizierung der magnetischen Nanopartikel herangezogen wird. Das LbL-Verfahren bietet nicht nur die Möglichkeit die Schichtdicke zu variieren, sondern ebenfalls durch Variation der ausgewählten Polyelektrolyte (Polyarcylsäure (PAA), Polyallylamin (PAH), Polyethylenimin (PEI) und Poly(4-styrolsulfonsäure)-co-Maleinsäure (PSSa-co-MA)), können diverse Wirkstoffe bzw. Biomoleküle in das Multischichtsystem einzubauen. Durch geschützten Wirkstofftransport kann die Überlebensrate der T-Zellen effektiv gesteigert werden und damit verbunden das Zeitfenster, in dem die Wirkstoff-beladenen T-Zellen ihren Zielort (z. B. Krebszellen oder Tumore) erreichen können. Der Aufbau von Multischichten auf der Partikeloberfläche wird mittels DLS, FT-IR-Spektroskopie sowie TEM-Aufnahmen erfolgreich nachgewiesen. Es stellt sich heraus, dass das Multischichtsystem, bestehend aus PAH und PAA sowie aus PEI und PSSa-co-MA, optimale Voraussetzungen für eine anschließende Funktionalisierung mit Doxorubicin liefert. Je nach dem welcher Polyelektrolyt die äußerste Schicht des Multischichtsystems bildet, erfolgt die Anbindung von Doxorubicin auf unterschiedliche Weise. Die Funktionalisierung der Nanopartikel wird mit FCS, DLS, FT-IR-, UV/Vis- und Fluoreszenz-Spektroskopie, sowie Zetapotential-Messungen charakterisiert. Durch Bestimmung der Doxorubicin-Konzentration, mittels UV/Vis zeigt sich, dass die Anbindung von Doxorubicin nur an die entsprechende äußerste Schicht erfolgte. Die Doxorubicin-Konzentration änderte sich mit steigender Schichtanzahl nicht. Versuche zur Verkapselung von Doxorubicin, sowie biologische Vortests zur Charakterisierung der funktionalisierten Nanopartikel werden derzeit durchgeführt. Ebenfalls wird für die Oberflächenbeschichtung der MnZn-MNP ausgewählte Bisphosphonate (Alendronsäure oder 1,1-Diphosphono-2,3-Dicarbonsäure) sowie synthetische Aminosäuren (6-Aminohexansäure) verwendet. Auf Grund der hohen Affinität von Bisphosphonaten zu Knochen, stellen diese beschichteten Nanopartikel ein mögliches Einsatzgebiet zur Behandlung von Knochenkrebs dar. Da der eingesetzte Wirkstoff keine Autofluoreszenz aufweist, müssen diese beschichteten Nanopartikel mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. FITC oder DAPI) markiert werden, um so den Einsatz von bildgebenden Analyseverfahren möglich zu machen. Durch die thermische Beständigkeit der Beschichtungsmaterialien erfolgte die Synthese der MnZn-Ferrite in deren Gegenwart. Es kann bei allen eingesetzten Materialien die erfolgreiche Beschichtung sowie die Anbindung von FITC bzw. DAPI nachgewiesen werden.Die synthetisierten, multifunktionalen MnZn-MNP zeigen insgesamt ein hohes Potential für eine spätere medizinische Anwendung. Hierbei verbinden diese funktionalisierten Partikel die physiko-chemischen Eigenschaften der Nanopartikel mit der therapeutischen Aktivität des Wirkstoffs.

The focus of this thesis is the synthesis of multifunctional magnetic nanoparticles for biomedical applications. Biocompatible ferrites with the chemical composition Mn0.8Zn0.2Fe2O4 are synthesized by the co-precipitation of the corresponding metal chlorides in sodium hydroxide solution. For application in biological organisms, the nanoparticles surface has been coated with different techniques with selected biocompatible polymers and functionalized with Doxorubicin, a chemotherapeutic drug. Following this the potential of Doxorubicin functionalized nanoparticles are in-vitro tested to be used in adoptive cancer immunotherapy, a new approach where immune cells, especially T lymphocytes, will be exploited as autonomous drug delivery systems with high target specifity. The activation of dextran is done by functionalisation via aldehyde, carboxymethyl or amino groups and subsequently the attachment of doxorubicin. The successful attachment of Doxorubicin to the dextran derivates coated nanoparticles is characterised by using dynamic light scattering (DLS), Raman-, FT-IR-, UV/Vis- and fluorescence spectroscopy. The uptake efficiency of the modified magnetic nanoparticles into T lymphocytes is verified by fluorescence and confocal microscopy. The functionality of the drug attached to the particles and internalized into cells is further characterised. Thus, among others, the cytotoxic effect evoked on T lymphocytes is determined and drug release kinetics are monitored. The layer-by-layer technique is the second method which is used for coating the nanoparticles surface. The LbL process offers the opportunity not only to vary the layer thickness but also by changing the selected polyelectrolytes like PAH (poly(allylamine hydrochloride)), PAA (polyacrylic acid), PEI (polyethyleneimine) or PSSa-co-MA (Poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid)) to encapsulate drugs or biomolecules in the different layers of the system. This protected drug delivery effectively increases the survival rate of the T cells and connected to this the time slot in which drug loaded T cells have to reach the target (cancer cells or tumors). Common techniques like transmission electron microscopy (TEM), FT-IR, Zetapotential and DLS are used to proof the success of the coating and the colloidal stability of the coated nanoparticles. It turns out the multilayer system consisting of PAH and PAA as well as of PEI and PSSa-co-MA show the highest potential for a subsequent functionalisation with Doxorubicin. Due to the polyelectrolyte building the last layer of the multilayer system the bonding of Doxorubicin takes place in different ways. The successful bonding of the drug to the LbL coated nanoparticles is verified by using Zetapotential, DLS, TEM, FT-IR, UV/Vis- and fluorescence-spectroscopy. Determining the concentration of Doxorubicin with UV/Vis-spectroscopy shows the bonding of the drug occurs only to (with?) the corresponding outer layer. The drug concentration does not change by increasing the number of layers. Tests for encapsulation of the drug as well as biology pre-test for the characterisation of the functional nanoparticles are presently running. The surface modification of the nanoparticles is also done by using selected bisphosphonates (alendronic acid or 1,1-diphosphono-2,3-dicarboxylic acid) and synthetic amino acid like 6-aminocaproic acid. Due to the high affinity of bisphosphonate coated particles to bones a possible application of these particles could be the treatment of bone cancer. In this case the used drug shows no specific fluorescence, therefore it is necessary to mark the coated particles additionally with a fluorescence dye like FITC or DAPI. Because of the thermal resistance of the used materials it is possible to synthesis the nanoparticles in the presence of the coating substance. In all cases the successful coating of the particles as well as the bonding of FITC or DAPI to the coated nanoparticles is verified. Due to this the drug loaded particles show a high potential for future drug delivery applications. The modified magnetic nanoparticles combine the physico-chemical properties of the nanoparticles with the therapeutic effectivity of the drug.