Development and characterisation of inhibitors of the E. coli methionine aminopeptidase

Abstract

After the expression and purification of the E. coli methionine aminopeptidase (MetAP), an assay system was developed. Experiments with fumagillin, a covalent inhibitor that inhibits angiogenesis, confirmed computational studies trying to calculate the protonation state of the active site. This enzyme is metal dependent, although the identity of the metal ion is not yet entirely clear. Co(II) activates all MetAPs known so far but also Mn(II) seems a promising candidate. The active site consists of five conserved residues surrounding two metal ions that are "connected'; by a bridging water molecule. Both the computational studies and the experiments investigating the pH-dependency of the binding of fumagillin indicated that two protonation states are possible: One (at a lower pH) is relevant for the binding of fumagillin, an epoxide that is more easily bound when it is protonated prior to the nucleophilic attack of a histidine near the active site. A more basic pH is relevant for the cleavage of substrates. The pKa-value of the bridging water molecule can be estimated to be about 7. Based upon these results, a modified reaction mechanism could be proposed and these differences might be exploited for the further design and development of anticancer agents. After this initial characterisation, a screening of inhibitors was performed and several hundred substances were tested. With the aid of molecular modeling and virtual screening it was possible to find an in vitro active substance: Thiabendazole, a known antifungal and antiparasitic drug has an IC50-value of about 500 nM. Subsequently, a series of thiabendazole-analogs was synthesized and tested. It became clear that only substances with a functional metal-binding motif are able to inhibit Co(II)-loaded EcMetAP. However, it was difficult to gain further insight into structure-activity relationships. In addition, all of the substances proved inactive against the Mn(II)-loaded EcMetAP. They were also unable to inhibit the growth of E. coli in concentrations up to 100 µg/ml in spite of supposedly acceptable pharmacokinetic properties and a high in vitro-potency with Co(II) present. Thus, it was decided to resolve the crystal structure of the EcMetAP with bound inhibitor. A new and surprising binding mode was the result: Thiabendazole exerts no direct interactions with the active site metal ions as could be expected. In contrast to other competitive inhibitors, thiabendazole binds via a third "auxiliary'; metal ion to a conserved histidine and blocks the entrance to the catalytic site. Further X-ray structures other inhibitors revealed an identical mode of action, indicating a possible generalisation of this binding mode. The unexpected binding mode explains the inactivity of many compounds when tested for antibacterial or anti-angiogenic activity, as the screening for inhibitors is normally done with (unphysiologically high concentrations of) Co(II) as the cofactor. Other divalent metal ions — although able to substitute for the Co(II) in the active site needed for enzymatic activity — seem to be unable to act as a binding-mediator. However, the Co(II)-complexes derived from these substances should have a higher inhibitory in vivo-potency than the "free substances';. The last step was therefore the proof of principle. Two of the compounds with the proven binding mode were used as model substances and their antibacterial effect against E. coli was tested again, but this time additional Co(II) was added to the growth medium of the bacteria. This action increased the potency of both thiabendazole and the second compound, thus confirming the expected effect and underlying the binding mode clarified by crystallization experiments. Even if the aim to get new, potent antibacterial drugs was only partly achieved, the in vitro results of the thiabendazole analogs together with the crystallization experiments could be used to develop a new scoring function (Turboscore) for predicting the binding affinities of compounds to a binding site with metal ions. With Turboscore, it is possible to distinguish between the active and the inactive substances which was not possible with commonly available functions such as ChemScore or with the scoring functions of GOLD. Thus, it will be possible to get reliable docking poses and affinity predictions in the future not only for virtual screening procedures with the EcMetAP but also with other target (metallo-) proteins where the crystal structure is available. In conclusion, in vitro screening results should always be considered very carefully, especially when working with metal-dependent enzymes. During this work, it was possible to combine experimental procedures, molecular modeling techniques and crystallization experiments to gain a deeper understanding of the target protein. Hopefully, the results presented here will be useful for the future design and development of anticancer, antibacterial, antifungal and antiparasitic drugs.

Nach der Aufreinigung der E. coli Methionin-Aminopeptidase (MetAP) wurde ein Testverfahren etabliert. Bei der MetAP handelt es sich um eine Metalloprotease. Allerdings ist unklar, welches Metall als Cofaktor in vivo fungiert. Co(II) aktiviert alle bisher bekannten MetAPs, daneben gilt aber auch Mn(II) als möglicher Cofaktor. Das aktive Zentrum besteht aus fünf konservierten Aminosäuren, die zwei Metallionen umgeben; die beiden Metallionen wiederum werden durch ein Wassermolekül überbrückt. Der Protonierungszustand dieses Wassermoleküls ist nicht bekannt und spielt eine Rolle beim Reaktionsmechanismus und bei der Bindung von Hemmstoffen. Sowohl Computersimulation als auch experimentelle Ergebnisse mit Fumagillin (einem kovalent bindenden Hemmstoff) ergaben, dass prinzipiell zwei Protonierungszustände möglich sind: Das überbrückende Wassermolekül lässt sich durch einen pKs-Wert von ca. 7 charakterisieren. Der Zustand bei einem niedrigeren pH-Wert ist relevant für die Bindung von Fumagillin, für die Spaltung von Substraten scheinen basischere Bedingungen günstiger zu sein. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte ein modifizierter Reaktionsmechanismus vorgeschlagen werden. Zusätzlich bieten diese Ergebnisse wichtige Hinweise für das zukünftige Design kovalent bindender Hemmstoffe und für die weitere Entwicklung von Krebstherapeutika. Um neue Hemmstoffe der E. coli MetAP zu entwickeln, wurden mehrere hundert Substanzen getestet. Mit der Hilfe von virtuellen Screening-Methoden konnte eine in vitro sehr aktive Substanz identifiziert werden: Thiabendazol, ein bekanntes Fungizid und antiparasitär wirkendes Arzneimittel mit einem IC50-Wert von ca. 500 nM. Eine Reihe von Analoga wurde synthetisiert und getestet. Es wurde klar, dass nur Substanzen mit einer potentiellen Metallbindungsstelle die Co(II)-aktivierte E. coli MetAP hemmen konnten. Es war allerdings schwierig, weitere Struktur-Wirkungs-Beziehungen zu erkennen. Zudem waren alle Substanzen unwirksam gegen das Mn(II)-aktivierte Enzym und konnten das Wachstum von E. coli Bakterien erst in einer Konzentration von über 100 µg/ml hemmen, obwohl sie an dem freien Enzym sehr potent waren und wahrscheinlich auch akzeptable pharmakokinetische Eigenschaften besitzen. Daher sollte die Kristallstruktur der E. coli MetAP mit gebundenem Hemmstoff aufgeklärt werden. Das Ergebnis war ein neuer und überraschender Bindungsmodus: Thiabendazol übt keinerlei direkte Wechselwirkungen mit den Metallionen des aktiven Zentrums aus, wie aufgrund von Strukturen mit anderen kompetitiven Hemmstoffen erwartet werden konnte. Stattdessen bindet Thiabendazol mit Hilfe eines dritten Metallions an ein Histidin in der Nähe des aktiven Zentrums und blockiert so dessen Eingang. Weiterführende Untersuchungen mit anderen Substanzen lassen den gleichen Bindungsmodus erkennen und deuten eine weite Verbreitung an. Dieser unerwartete Bindungsmodus erklärt die antibakterielle oder auch antiangiogenetische Unwirksamkeit vieler Substanzen — schließlich wird das Screening neuer Hemmstoffe normalerweise mit (unphysiologisch) hohen Co(II)-Konzentrationen durchgeführt. Andere Metallionen können nicht als "Bindungsvermittler" fungieren, auch wenn sie anscheinend die Co(II)-Ionen im aktiven Zentrum ersetzen können. Die Co(II)-Komplexe sollten bei vorausgesetzter Stabilität zumindest theoretisch eine höhere in vivo-Potenz besitzen als die "freien" Substanzen. Der letzte Schritt war der Beweis des Bindungsprinzips: Zwei der Substanzen, die als Co(II)-Komplexe binden, wurden ein weiteres Mal auf ihre antibaktielle Aktivität untersucht, allerdings wurde diesmal Co(II) zugegeben. Dadurch konnte in beiden Fällen eine signifikante Verstärkung der Hemmwirkung festgestellt werden. Auch wenn das Ziel neue, potente antibakteriell wirksame Stoffe zu finden nur zum Teil erreicht wurde, war es möglich, anhand der Kristallisationsexperimente in Kombination mit den in vitro-Ergebnissen eine neue Scoring-Funktion namens Turboscore für das virtuelle Screening von Substanzen zu entwickeln. Diese Funktion besitzt spezielle Parameter um Bindungsaffinitäten zwischen Heteroatomen und Metallionen zu bewerten. Mit Turboscore ist es möglich, zwischen aktiven und inaktiven Substanzen zu unterscheiden, was mit kommerziell erhältlichen Programmen wie GOLD oder ChemScore nicht gelungen war. Mit Turboscore wird es möglich sein, für virtuelle Screening Versuche auch mit anderen metallabhängigen Proteinen in der Zukunft zuverlässige Docking-Positionen zu erhalten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in vitro Versuche immer vorsichtig bewertet werden sollten. Bei dieser Arbeit ist es gelungen, durch eine Kombination von experimentellen Verfahren, computerunterstützten Modeling-Versuchen und Kristallstrukturuntersuchungen ein tieferes Verständnis der E. coli MetAP zu erhalten. Hoffentlich werden die präsentierten Ergebnisse nützlich sein für die weitere Entwicklung von antibakteriellen, fungiziden, antiparasitären Wirkstoffen bzw. Krebstherapeutika.