Kulturbasierte und kulturunabhängige molekulare Endokarditis-Diagnostik aus Herz-Biopsien

Abstract

Die 16S-rDNA-PCR als Diagnostikum der infektiösen Endokarditis wird in den aktuellen modifizierten Duke-Kriterien nicht berücksichtigt. Die vorliegende Promotionsarbeit dient der Evaluation der Bedeutung dieser Methode im diagnostischen Prozess bei Verdacht auf Vorliegen einer infektiösen Endokarditis auf Grundlage einer bisher in der Literatur nicht beschriebenen Datenmenge. Im Rahmen der Studie wurden am Universitätsklinikum des Saarlandes im Zeitraum von August 2008 bis Januar 2012 1153 primär unselektierte, intraoperativ entnommene Herzbiopsien mikrobiologischer Diagnostik unterzogen. Die konventionellen Methoden zum Erregernachweis bestehend aus Gram-Färbung und kultureller Anzucht von bioptischem Material wurden durch die kulturunabhängige molekularbiologische Methode der 16S-rDNA-PCR, gefolgt von anschließender Sequenzierung der Nukleotidsequenz, ergänzt. Bei klinischem Verdacht auf Vorliegen einer infektiösen Endokarditis wurden Blutkulturen in unterschiedlicher Anzahl abgenommen. Im Rahmen der qualitativen Analyse der verfahrensspezifischen Erregerspektren wurden nach kultureller Anzucht des bioptischen Materials signifikant häufiger typische Vertreter der Hautflora gefunden (n = 178/209; 85,2 %), wohingegen mittels 16S-rDNAPCR/ Sequenzierung klassische Erreger der infektiösen Endokarditis signifikant häufiger nachgewiesen wurden (n = 88/121; 72,7 %). Der quantitative Vergleich der Verfahren zeigte deutlich höhere Raten des Nachweises von Erregern für die kulturelle Anzucht (n = 209 vs. n = 121 im Rahmen der 16S-rDNA-PCR), was in Zusammenschau mit den qualitativen Unterschieden als Hinweis auf die höhere Spezifität der molekularbiologischen Verfahren einhergehend mit einer niedrigeren Frequenz falsch-positiver Ergebnisse gewertet werden kann. Durch die Gegenüberstellung der unterschiedlichen Befundkonstellationen nach Synopsis der kulturellen und molekularbiologischen Ergebnisse wurde gezeigt, dass die 16S-rDNAPCR/ Sequenzierung einen wichtigen Beitrag in der Diagnostik kulturnegativer Endokarditiden (n = 76) leisten kann. Insbesondere Vertreter der HACEK-Gruppe, Coxiella burnetii und Tropheryma whipplei konnten ausschließlich mittels 16S-rDNAPCR/ Sequenzierung nachgewiesen werden (n = 4). Eine weitere sinnvolle Anwendung fanden die molekularbiologischen Verfahren in der Verifizierung bzw. Falsifizierung von kulturell erfolgten Nachweisen von typischen Hautkeimen. Die klinische Bedeutung positiver kultureller Erregernachweise bei gleichzeitigem Vorliegen eines negativen 16S-rDNA-PCR/Sequenzierungsbefunds (n = 164) wurde dabei durch zwei Befunde in Frage gestellt: Im Vergleich mit den PCR-positiven Befundkonstellationen wurden prinzipiell kontaminationsverdächtige typische Hautkeime bei negativem 16S-rDNA-PCR/Sequenzierungsergebnis kulturell signifikant häufiger nachgewiesen (n = 157/164; 95,7 % vs. n = 33/121; 27,3 % bei PCR-positiven Befundkonstellationen). Des Weiteren wurde gezeigt, dass im Vergleich mit der Befundkonstellation mit identischem Erregernachweis bei Vorliegen eines negativen 16SrDNA- PCR-Ergebnisses und positiver Kultur der Erregernachweis signifikant häufiger erst im Rahmen der kontaminationsanfälligen Anreicherungskultur mittels Flüssigmedien gelungen ist (n = 156/164; 95,1 % vs. n = 4/35; 11,4 % in der Gruppe mit identischen Ergebnissen im Rahmen der Kultur und 16S-rDNA-PCR). Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse den Schluss zu, dass es sich bei den kulturell positiven Befunden mit negativem Ergebnis im Rahmen der 16S-rDNA-PCR/Sequenzierung mit erhöhter Wahrscheinlichkeit um den Nachweis von Kontaminanten handeln könnte, die erst nach Einsatz molekularbiologischer Methoden begründet als solche verdächtigt werden können. In Zusammenschau der Ergebnisse der kulturellen Anzucht des bioptischen Materials, der Blutkultur und der 16S-rDNA-PCR/Sequenzierung wurde deutlich, dass der molekularbiologische Erregernachweis eine wichtige Rolle beim Klären von Diskrepanzen innerhalb der konventionellen Diagnostika (n = 157) spielen kann. Schlussendlich diente die 16S-rDNA-PCR/Sequenzierung auch zur Verifizierung bzw. Falsifizierung übereinstimmend positiver oder negativer konventioneller Methoden (n = 237), was die diagnostische Sicherheit der Befunde erhöht hat. Die Rolle der molekularbiologischen Verfahren im Rahmen der Diagnostik der infektiösen Endokarditis konnte abschließend durch einen errechneten Youden-Index von 0,938 untermauert werden, der deutlich über denen der konventionellen diagnostischen Verfahren lag (max. 0,301 für kulturelle Anzucht auf Festmedien). In Anbetracht der diagnostischen Vorteile und der stetigen Weiterentwicklung und -verbreitung kulturunabhängiger Verfahren erscheint die Aufnahme in die Duke-Kriterien angebracht.

16S rDNA PCR as a diagnostic means of infectious endocarditis is not being appreciated in the current version of the modified Duke criteria. The aim of this thesis is therefore to evaluate the relevance of this method in the diagnostic process of cases of supposed infectious endocarditis on the basis of a database previously undescribed in literature. In this study, a total of 1153 primarily unselected, extirpated heart biopsies taken from August 2008 until January 2012 were subject to microbiological diagnostics in the Saarland University Medical Center. Conventional methods for the detection of a possible causative pathogen such as gram-staining and culture have been complemented by the cultureindependent molecular biological method of 16S rDNA PCR, followed by direct sequencing of the nucleotide sequence. In case of clinical suspicion of infectious endocarditis, different numbers of blood culture vials have been taken. In the context of the qualitative analysis of the procedure-specific range of pathogens, conventional culture of bioptic material yielded a significantly higher amount of typical representatives of the skin flora (n = 178/209; 85.2 %), whereas classic causative agents of infectious endocarditis were significantly more often detected with 16 S rDNA PCR/sequencing (n = 88/121; 72.7 %). The quantitative comparison of the different methods showed a markedly higher rate of detection of pathogens with conventional culture (n = 209 vs. n = 121 with 16S rDNA PCR), which in synopsis with the qualitative differences can be considered an indication of the increased specificity and the lower rate of false-positive findings in molecular biological methods. The synopsis of the findings in conventional culture and molecular biological methods followed by the comparison of the different diagnostic constellations highlights the important contributions of 16S rDNA PCR followed by direct sequencing to the diagnostics of cases of culture-negative infectious endocarditis (n = 76). Above all, representatives of the HACEK group of pathogens, Coxiella burnetii and Tropheryma whipplei could only be detected with 16S rDNA PCR followed by direct sequencing (n = 4). Molecular biological methods are also of use when it comes to verifying or falsifying cases of cultural detection of typical skin pathogens. The clinical significance of positive cultures with negative results in 16S rDNA PCR (n = 164) followed by direct sequencing is questioned by two findings: Typical skin pathogens suspicious of being contaminants have been detected with a significantly higher rate in biopsies falling into the culture-positive/16S rDNA PCR 7 negative category (n = 157/164; 95.7 % vs. n = 33/121; 27.3 % in PCR-positive constellations). Moreover the comparison between the cases of identical conventional and molecular biological identification of the pathogen and the culture-positive cases with negative results in 16S rDNA PCR followed by direct sequencing shows that the positive findings of pathogens in the latter group coincide with a significantly higher rate of positive enrichment cultures using liquid growth media (n = 156/164; 95.1 % vs. n = 4/35; 11.4 % in the group featuring identical results in culture and 16S rDNA PCR) which are inherently prone to contamination. In summary, these results allow the conclusion that the culture-positive cases with negative results in 16S rDNA PCR followed by direct sequencing are characterized by a higher share of contaminants compared to the other diagnostic constellations. However, the possibility of contamination can only be reasonably considered if there is molecular biological evidence pointing in this direction. The synopsis of the results of valve culture, blood culture and 16S rDNA PCR/direct sequencing shows that the molecular biological methods can be a useful tool in clearing up discrepancies between the conventional cultural methods (n = 157). Another important application of 16S rDNA PCR/direct sequencing can be found in the verification of identical results of the conventional diagnostic means (n = 237), leading to improved diagnostic reliability. Finally, molecular biological methods could be shown to be characterized by a Youden index of 0.938, a value remarkably higher than those of the conventional diagnostic means headed by a Youden index of 0.301 characterizing culture on solid growth media. In the light of the diagnostic advantages, constant improvements and ongoing development and the increasingly widespread availability of culture-independent techniques, the inclusion of these methods in the Duke criteria should be considered.