Engineering of Cytochrome P450s CYP109E1 and CYP109A2 from Bacillus megaterium DSM319 for the production of vitamin D3 metabolites

Abstract

Active vitamin D3 metabolites play an essential role in the maintenance of calcium and phosphorus homeostasis. The conventional chemical synthesis of this metabolite is time-consuming, environmentally unfriendly and often results in low yield. Therefore, the biotechnological production of active vitamin D3 metabolites is of great importance to the pharmaceutical industry. Hereby, cytochrome P450 enzymes have the potential to achieve this goal. The present work reports on the optimization of a biotechnological process in Bacillus megaterium MS941 for the production of vitamin D3 metabolites. On that account, two cytochrome P450 enzymes were used as biocataylsts, namely CYP109E1 and CYP109A2 from the Gram-positive bacterium Bacillus megaterium DSM319. Both enzymes were subjected for functional and structural characterization in order to optimize their activity and/or regio-selectivity towards vitamin D3. In terms of hydroxylation activity, it has been shown that the conversion of vitamin D3 with CYP109E1 results in the formation of several derivatives, while CYP109A2 shows clearly a higher regio-selectivity towards 25- hydroxylation. The elucidation of the crystal structure of both enzymes provides detailed insights into the geometry of these enzymes. By means of molecular docking, site-directed mutagenesis was successfully performed, resulting in the creation of mutants with higher regio-selectivity compared to the wild type, in particular when using CYP109E1. The enhancement of the regio-selectivity of this P450 resulted in a higher yield of the valuable metabolite 25-hydroxyvitamin D3. A two-fold increase of the 25-hydroxyvitamin D3 yield was achieved after the substitution of I85 by tryptophan or alanine. The engineering of CYP109A2 resulted also in a slight increase in the 25-hydroxyvitamin D3 yield compared to the wild type. Summarizing, it has been shown that CYP109E1-I85W, CYP109A2-, - or CYP109-T103A-based whole-cell systems are a competitive methods for the production of 25-hydroxyvitaminA

Vitamin-D3-Metaboliten spielen eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Calcium- und Phosphor-Homöostase. Die herkömmliche chemische Synthese dieser Metaboliten ist zeitaufwendig, umweltschädlich und führt oft zu geringer Ausbeute. Daher ist die biotechnologische Herstellung von aktiven Vitamin-D3-Metaboliten für die pharmazeutische Industrie von großer Bedeutung. Der Einsatz von Cytochromen P450 gilt hierbei als vielversprechend. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Optimierung eines biotechnologischen Prozesses in Bacillus megaterium MS941 zur Produktion von Vitamin-D3-Metaboliten. Als Biokatalysatoren wurden zwei Cytochrome-P450-Enzyme verwendet, nämlich CYP109E1 und CYP109A2 aus dem Gram-positiven Bakterium Bacillus megaterium DSM319. Beide Enzyme wurden einer funktionellen und strukturellen Charakterisierung unterzogen, um ihre Aktivität und / oder Regio-Selektivität gegenüber Vitamin-D3 zu optimieren. Bezüglich der Hydroxylierungsaktivität wurde gezeigt, dass die Umwandlung von Vitamin-D3 mit CYP109E1 zur Bildung mehrerer Derivate führt, während CYP109A2 deutlich eine höhere Regio-Selektivität bezüglich einer 25-Hydroxylierung zeigt. Die Aufklärung der Kristallstruktur beider Enzyme liefert detaillierte Einblicke in die Geometrie dieser Enzyme. Mit Hilfe des molekularen Dockings wurde eine ortsgerichtete Mutagenese erfolgreich durchgeführt, wodurch im Vergleich zum Wildtyp, insbesondere von CYP109E1, Mutanten mit höherer Regio-Selektivität hergestellt wurden. Die Optimierung der Regio-Selektivität dieses P450 führte zu einer höheren Ausbeute des wertvollen Metaboliten 25- Hydroxyvitamin-D3. Die Produktion von 25-Hydroxyvitamin-D3 konnte durch die Substitution von I85 durch Tryptophan oder Alanin verdoppelt werden. Die Optimierung von CYP109A2 führte ebenfalls zu einem leichten Anstieg der 25-Hydroxyvitamin-D3- Ausbeute im Vergleich zum Wildtyp. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass CYP109E1- I85W-, CYP109A2-, oder CYP109-T103A-basierte Ganzzellsysteme eine wettbewerbsfähige Methode zur Herstellung von 25-Hydroxyvitamin-D3 unter den bisher etablierten biotechnologischen Verfahren darstellen.