PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Der Prozess der Transkription umfasst das Umschreiben von DNA in RNA und ist somit Teil der Genexpression. Das Transkriptom ist die Gesamtheit aller RNA in einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt. Die Transkription besteht im Wesentlichen aus drei Unterprozessen: der Transkriptionsinitiation, der -termination und der Transkript-Degradation. An allen drei Unterprozessen sind eine Vielzahl von Enzymen und Proteinen beteiligt, die diese Prozesse katalysieren und regulieren.

Die in den letzten Jahren entwickelte Technologie der Transkriptom- bzw. RNA-Sequenzierung ermöglicht die Hochdurchsatz-Sequenzierung aller Transkripte und somit ganzer Transkriptome mit Einzelnukleotidauflösung. Darüber hinaus bildet sie einen extrem hohen dynamischen Bereich für die relative Quantifizierung von Transkripten ab. Neben der klassischen RNA-Sequenzierung von Volllängentranskripten wurden weitere Methoden entwickelt, um beispielsweise Primärtranskripte spezifisch anzureichern und somit Transkriptionsstarts genomweit zu identifizieren.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Transkriptome in den medizinisch und industriell relevanten Corynebakterien *Corynebacterium diphtheriae* und *C. glutamicum* hinsichtlich der RNA-Synthese und des RNA-Abbaus untersucht. Im Speziellen wurden die oben genannten Prozesse der Transkriptionsinitiation und -termination sowie der Transkript-Degradation analysiert.

Obwohl das Genom von *C. diphtheriae* seit etwa 15 Jahren bekannt ist, ist nur wenig über die transkriptionelle Organisation dieses wichtigen Humanpathogens bekannt. Mittels Primärund Volllängentranskript-Sequenzierung wurden in dieser Arbeit eine umfassende Analyse der genetischen Elemente, wie des σA Promotormotivs, 5’-UTRs sowie Operonstrukturen durchgeführt. Von 1.656 identifizierten Transkriptionsstarts (TSS) wurden 1.202 TSS bekannten und 454 TSS neuen Transkripten, wie antisense RNAs, zugeordnet. Insgesamt wurde ca. 87 % des *C. diphtheriae* Genoms als aktiv transkribiert nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Gen-Annotation von 120 Genen anhand der identifizierten TSS verbessert. Über die Volllängentranskriptdaten wurde außerdem das DtxR-Regulon, welches unter anderem das Diphtheritoxin-kodierende tox Gen umfasst, charakterisiert. Für das tox Gen wurden bisher unbekannte antisense RNAs und benachbarte intergenische Transkripte nachgewiesen, die möglicherweise regulatorische Funktionen besitzen.

Neben der Transkriptionsinitiation und daraus abgeleiteter Informationen in *C. diphtheriae* wurde in dieser Arbeit in dem industriell genutzten Aminosäureproduzenten *C. glutamicum* die Rho-abhängige Transkriptionstermination untersucht. Mittels RNA-Sequenzierung einer ∆rho-Mutante wurde gezeigt, dass der Rho-Faktor überwiegend antisense RNAs terminiert und DNA aus Fremdquellen, wie Prophagen-Gene und Transposons, transkriptionell stilllegt. Des Weiteren wurde die Funktion und genetische Struktur eines durch den Rho-Faktor regulierten DNA-Aufnahmesystems in *C. glutamicum* nachgewiesen. Anhand von 3’-verlängerten Transkripten wurden 930 Rho-abhängig terminierte Transkripte im *C. glutamicum* Genom identifiziert. Die Analyse der Rho-abhängig terminierten Transkripte ergab eine von *Escherichia coli* Rho abweichende Rho-Erkennungsstelle (rut site), sodass die für *E. coli* Rho bekannten C-reichen rut sites kein Erkennungsmerkmal für *C. glutamicum* Rho darstellen.

Von der Zelle nicht mehr benötigte Transkripte werden über die Transkript-Degradation abgebaut. Die Vielzahl an der Transkript-Degradation beteiligter RNasen und anderer Proteine erlaubt eine sehr feingliedrige Regulation und damit strenge Prozesskontrolle. Im Vergleich zu den Modellorganismen *E. coli* und *Bacillus subtilis*, dessen wichtigste RNasen die RNasen E bzw. J und Y darstellen, besitzt *C. glutamicum* ein abweichendes RNase-Repertoire bestehend aus RNase E/G und J. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Einflüsse der RNasen E/G und J auf das *C. glutamicum* Transkriptom analysiert. So wirken sich die Deletionen der für RNase E/G und RNase J kodierenden Gene besonders stark auf das Transkriptom aus. Über eine in dieser Arbeit entwickelte RNA-Sequenzierungsmethode zur transkriptomweiten Identifizierung von RNase- Schnittstellen, wurden 2.528 RNase E/G und 5.850 RNase J Schnittstellen im Transkriptom von *C. glutamicum* identifiziert. Die Verteilung der Schnittstellen ergab für beide RNasen charakteristische Muster. So wurde über eine graduelle Abnahme der Schnittstellenverteilung, eine 5’-3’-Exoribonuklease-Aktivität für RNase J gezeigt. Für die Endoribonuklease RNase E/G wurde eine Schnitt-Präferenz im vorderen Transkriptbereich und das Motiv AAA⇓CUU nachgewiesen.

Die hier vorgestellten Ergebnisse erweitern das Wissen über die Transkriptionsinitiation in *C. diphtheriae* und legen den Grundstein für darauf aufbauende Transkriptomanalysen. Darüber hinaus erlauben die hier präsentierten Ergebnisse tiefe Einblicke in die Transkriptionstermination und Transkript-Degradation in *C. glutamicum* und ermöglichen ein besseres Verständnis dieser stark regulierten Transkriptionsprozesse.