Ein Hochdurchsatz-Screeningsystem zur Objekterkennung in Mikroskop-Farbbildern im Rahmen der Analyse pflanzlicher Pathogenresistenz

Abstract

ie vorliegende Dissertation beschreibt die ingenieurtechnische Entwicklung eines Hochdurchsatz-Screeningsystems zur bildbasierten Analyse von Mikroskoppräparaten als Automatisierung bis dato manuell durchgeführter Auswertungen. Technische Voraussetzung ist ein computergesteuertes motorisiertes Mikroskop mit Digitalkamera, welches hochaufgelöste und rauscharme Farbbilder des zu analysierenden Probenmaterials bereitstellt. In den Bildern finden sich grünbläulich gefärbte Zellen der oberen Epidermis von Gerstenblättern, welche mittels labortechnischer Präparation einer genetischen Transformation unterzogen wurden. Biologischer Hintergrund der vorgelegten Arbeit ist die Erlangung von Erkenntnissen zur Rolle bestimmter Gene der Pflanze bezüglich einer Resistenz gegen Mehltau. Dazu ist in den zu untersuchenden Zellen die Existenz des Mehltaupilzes in Form so genannter Haustorien zu detektieren und die Zelle den Klassen "infiziert" (ein Haustorium oder mehrere Haustorien vorhanden) bzw. "nicht infiziert" (kein Haustorium vorhanden) zuzuordnen. Auf Basis des Bunttons werden die gefärbten, genetisch transformierten Zellen mittels des Canny-Kantendetektors zunächst grob segmentiert (Finden relevanter Bildausschnitte), anschließend erfolgt eine Verfeinerung der Segmentierung im betrachteten Bildausschnitt unter Zuhilfenahme eines aktiven Konturmodells, welches sich anhand der mittels eines adaptiven Farbraums bestimmten Bildmerkmale um die zu untersuchende Zelle legt. Die anschließende Kontrastverstärkung mittels morphologischer Zylinderhuttransformationen ermöglicht eine robuste Segmentierung potenzieller Haustorienregionen innerhalb der Zelle. Zur Zurückweisung von Störungen, welche aufgrund des schwachen Farbkontrasts zwischen Zellgewebe und Haustorium sowie potenziell vorhandener Störobjekte innerhalb der Zelle auftreten, wird anschließend eine objektbasierte Klassifikation durchgeführt, die das segmentierte Objekt den Klassen "Haustorium" bzw. "kein Haustorium" zuweist. Mittels der verwendeten Formmerkmale wird eine Korrektklassifikationsrate von mehr als 90% erreicht, was eine hinreichend exakte Erstellung einer Statistik des haustoriellen Anfälligkeitsindex der Zellen und damit die Beantwortung der biologischen Fragestellung ermöglicht. Die besondere Herausforderung der Arbeit bestand darin, sowohl allgemeine menschliche Erkennungs- und Kognitionsleistung als auch biologisches Expertenwissen in das System zu integrieren und dabei eine Flexibilität zu gewährleisten, die eine Adaption an ähnliche Fragestellungen ermöglicht. Zusammen mit der implementierten vollautomatischen Ablaufsteuerung für die mikroskopseitige Bildaufnahme ergibt dies ein Laborassistenzsystem, welches dem Experimentator sehr zeitaufwändige Routineaufgaben abnimmt und ihm ein objektives Werkzeug zur Verfügung stellt, das u.a. durch Anbindung an eine Datenbank eine Dokumentation und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ermöglicht.

This thesis describes the development of a high-throughput screening system for image-based analysis of LM-micrographs as an automation of so far manual screening tasks. Hardware basis is a computer-operated, motorized microscope, equipped with a digital camera, which produces high-resolution low-noise color images of the specimens. These images contain greenish-blue dyed cells of the upper epidermis of barley leaves which were genetically transformed by biotechnological preparation. The biological background is the desire to understand the influence of certain plant genes on a resistance against powdery mildew. Therefore, the powdery mildew fungus has to be detected in terms of a so-called haustorium (which actually acts as a sucker and feeds the fungus by leaching the cell). The considered cells have to be classified into "infected" (one haustorium or several haustoria present) or "not infected" (no haustorium present). Based on the hue feature, the dyed genetically transformed cells are first segmented in a coarse manner (finding regions of interest). Subsequently, the cell segmentation is improved by using an active contour model in connection with an adaptive color space. As an intermediate result, each dyed cell is accurately segmented according to its cell boundary. Afterwards, potential haustoria regions are segmented inside these cells by a contrast enhancement via morphological top-hats. Due to the low contrast between haustoria and the remaining cell tissue the segmentation also catches other objects, such as the cell nucelus or several discolorations. Therefore, a succeeding object classification based on shape features assigns the segmented objects to the classes "haustorium" or "no haustorium". With this processing pipeline a classification accuracy of more than 90% is obtained which provides sufficiently exact results to build a statistical analysis of the haustoria susceptibility index thereon and to finally answer the relevant biological questions. The special challenge of this work was both to build a robot system with special human recognition abilities and to ensure a flexibility which offers an adaptation of this solution to similar problems. In connection with the fully automatic microscope control, i.e., the automatic image acquisition, the developed solution provides a laboratory assistant system helps the biological experimenter with very time-consuming routine jobs and provides a much less subjective analysis tool which enables a high-quality documentation and tracebility of the results via database access.