Funktionelle Charakterisierung des putativen Tumorsuppressorgens SFRP3 im humanen nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom

Schlensog, Martin; Pradel, Gabriele; Dahl, Edgar

doi:10.18154/RWTH-2017-06581

Funktionelle Charakterisierung des putativen Tumorsuppressorgens SFRP3 im humanen nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom = Functional characterization of the putativ tumor suppressor gene SFRP3 in human non-small cell lung cancer

Schlensog, Martin

2017

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Martin Schlensog

ImpressumAachen 2017

Umfang1 Online-Ressource (216 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2017

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Dahl, Edgar (Thesis advisor) ; Pradel, Gabriele (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2017-05-04

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2017-06581
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/696052/files/696052.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/696052/files/696052.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Lehrstuhl für Pathologie (528001-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Lungenkarzinom (frei) ; WNT Signalweg (frei) ; SFRP3 (frei) ; Methylierung (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Bronchialkarzinome stellen die häufigste Krebstodesursache bei Männern sowie die zweithäufigste bei Frauen in Deutschland dar. Aufgrund fehlender adäquater Früherkennungsmaßnahmen werden Lungenkarzinome zumeist zufällig oder in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert. Das Ziel molekularbiologischer Grundlagenforschung ist ein tiefergehendes Verständnis molekularer Vorgänge sowie die Analyse des Einflusses wichtiger aberranter Signalwege auf die Progression des Bronchialkarzinoms detailliert zu untersuchen. Neben dem EGFR-Signalweg (Kosaka et al. 2004; Shigematsu et al. 2005; Wu et al. 2008) weist ebenso der kanonische WNT-Signalweg in vielen Tumorentitäten, inklusive dem Lungenkarzinom, genetische Aberrationen auf. Eine erhöhte Expression der extrazellulären WNT-Liganden sowie der Verlust von WNT-Antagonisten oder Mitgliedern des ß-Catenin-Destruktionskomplexes steht im Kontext eine konstitutive Aktivität des kanonischen WNT-Signalweges zu unterstützen. Dennoch ist bisher keine Studie bekannt, die mögliche Expressionsmuster wichtiger WNT-Moleküle in den einzelnen Bronchialkarzinomsubtypen systematisch vergleicht. Im Rahmen dieser Arbeit resultierte eine Clusteranalyse extrazellulärer WNT-Liganden sowie Antagonisten innerhalb der NSCLC-Subtypen des unabhängigen The Cancer Genome Datensatzes (TCGA) in der erstmaligen Beobachtung einer möglichen subtypspezifischen Aktivität des WNT-Signalweges. In diesem Zusammenhang validierten Box Plot Analysen des Expressionsprofils zentraler Zielgene des kanonischen WNT-Signalweges eine erhöhte Expression im Adenokarzinom der Lunge. Weiterhin zeigte die initale Analyse, dass die WNT-Antagonisten der Secreted Frizzled Related Protein Familie (SFRP) ebenfalls einem subtypspezifischem Expressionsmuster unterliegen. SFRP1 und SFRP2 sind die am häufigsten untersuchtesten WNT-Antagonisten, wobei deren Herunterregulation mit der Karzinogenese verschiedenster Tumoren in Verbindung gebracht werden konnte. Über die mögliche Regulation von SFRP3 sowie dessen potentieller Einfluss auf die Progression des NSCLC ist bisher wenig bekannt. Nachfolgende Untersuchungen eines Frischgewebekollektives und des TCGA Datensatzes verdeutlichten einen Verlust der SFRP3 mRNA Expression in NSCLC-Patienten. Zudem wurde deutlich, dass die SFRP3 Herabregulation in Adenokarzinomen der Lunge mit fortschreitendem Tumorstatus sowie mit einer Verschlechterung der Patientenprognose einhergeht. Immunhistochemische Analysen primärer NSCLC-Proben sowie Lungennormalgewebe zeigten erstmalig die SFRP3-Proteinexpression in Typ I und Typ II Pneumozyten sowie im Zilien-behafteten Epithel. Methylierungsanalysen verdeutlichten eine4signifikante Steigerung der SFRP3 Exon1-Methylierung, wobei eine epigenetische Inaktivierung des SFPR3-Lokus in LUAD bestätigt werden konnte. Zur Evaluierung der biologischen Bedeutung eines SFRP3-Verlustes auf die Progression des NSCLC wurde anschließend auf Basis von gain-of-function Modellen das funktionelle Wirkspektrum von SFRP3 untersucht. Während die LUSC-Zelllinie H157 keine Veränderungen tumorrelevanter Eigenschaften nach forcierter SFRP3 Expression aufwies, zeigte die LUAD-Zelllinie A549 zunächst ein migrationsförderndes Verhalten sowie eine mesenchymale Zellform mit einhergehender Verstärkung des Aktin-Zytoskelettes. Eine zusätzliche Transfektion mit WNT1 in SFRP3-exprimierenden A549-Zellen hatte eine signifikante Reduktion der Proliferation zur Folge. Ein möglicher Wirkmechanismus konnte durch die Bestimmung des CyclinD1 Expressionsprofils der doppelt-transfizierten A549-Zellen, mit dem Resultat einer potentiell WNT-antagonistischen Funktion von SFRP3 bei einem durch WNT1 aktivierten Signalweg, aufgedeckt werden. Von klinischer Bedeutung zeigte sich die Kohärenz der positiven SFRP3-WNT1-Korrelation im Adenokarzinom der Lunge.Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit erstmals gelungen eine subtypspezifische Aktivität des WNT-Signalweges im NSCLC darzulegen. Darüber hinaus konnte SFRP3 als neues, putatives Tumorsuppressorgen bei aktivem, durch WNT1-induzierten WNT-Signalweg im Adenokarzinom der Lunge charakterisiert werden.

Lung cancer remains the leading cancer related death among men and the second most common among women in Germany, while it is diagnosed mostly accidentally or in advanced stages due to missing adequate early detection. Fundamental research tend to analyze in detail the moleculare processes and crucial abberant pathways leading to lung cancer progression. In the last decade distinct moleculare investigations were established to analyze genetical alterations of the tumor relevant EGFR pathway (Kosaka et al. 2004; Shigematsu et al. 2005; Wu et al. 2008). However, genetical abberations of the canonical WNT signaling pathway are equally crucial to tumor progression of various cancer subtypes, e.g. lung cancer. Increased expression of extra cellular WNT ligands or the loss of WNT antagonists as well as members of the ß-Catenin destruction complex are linked to promote a constitutive active canonical WNT signaling. To date no investigation systematically compared the expression profile of important WNT molecules in the individual non-small cell lung cancer subtypes: adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. The present studie analyzed for the first time the expression pattern of extra cellular WNT ligands and antagonists within the NSCLC subtypes resulting in a potential subtype specific activation of the WNT signaling pathway. In this context Box Plot analysis of the expression profile of pivotal WNT target genes validated an increased expression of these genes in adenocarcinoma of the lung. Furthermore, the expression patterns of WNT antagonists of the secreted frizzled related protein (SFRP) members were also liable to a subtype specific expression. SFRP1 and SFRP2 are the most investigated WNT antagonists. Downregulation of SFRP1 and SFRP2 was linked to tumor progression of various cancer subtypes and epigenetic silencing of both molecules was already analyzed in non-small cell lung cancer. The pontential regulation of SFRP3 as well as its influence on progression of NSCLC is unknown. Continuative investigations of a cryopreserved tissue collective and the independent TCGA dataset resulted in a loss of SFRP3 expression in primary NSCLC tissues. Furthermore, a progression line of adenocarcinoma patients indicated a downregulation of SFRP3 expression due to progressive tumor stage linked to a poor clinical outcome. Immunhistochemical analysis of primary NSCLC and normal lung tissue visualized for the first time the SFRP3 protein localization in type I and type II pneumocytes as well as in ciliated epithelium of bronchioles and validated SFRP3 protein reduction in primary NSCLC tissues. Qualitative and quantitative methylation examinations clarified a significant increase of SFRP3 exon I methylation, while the association between SFRP3 hypermethylation and mRNA reduction could be verified in6LUAD samples of the TCGA dataset. The present studie supposed to investigate the potential influence of SFRP3 loss to development and progression of the human non-small cell lung cancer. In this context the establishment of gain-of-function models constituted the background of futher functional investigations. The LUAD cell line A549 visualized initially an increased cell motility behavior as well as a mesenchymal cell formation with accompany of actin cytoskeleton strengthening due to high SFRP3 expression. However, the transfected LUAD cell line A549 exhibited low constitutaional WNT1 mRNA expression, for which reason the canonical WNT signaling pathway was assumed to be insufficient active. Proliferation analysis of SFRP3/WNT1 double transfected A549 cells showed a significant decrease of cell growth. In line, expression analysis of the canonical WNT target gene CyclinD1 resulted in a highly significant decrease of CyclinD1 mRNA expression in double transfected A549 cells. These results leading to the hypothezise of a potentially WNT antagonistic function of SFRP3 in a WNT1 dependent manner. Kaplan-Meier survival analysis verified the clinical importance of the WNT1 and SFRP3 association implicating a beneficial clinical outcome for LUAD patients with high SFRP3 as well as WNT1 expression.In summary, the present studie identified a subtype specific activity of the WNT signaling pathway in NSCLC for the first time. Furthermore, the potential tumor suppressor function of SFRP3 was confirmed in association to a WNT1 induced and active canonical WNT signaling pathway in adenocarcinoma of the lung. Additionally, a WNT indepent and potentially tumor promoting function of SFRP3 may persist.

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