Charakterisierung der akzessorischen Proteine vom felinen Coronavirus (FCoV) mit monoklonalen Antikörpern

Lemmermeyer, Tanja

Doctoral Thesis

2014

Charakterisierung der akzessorischen Proteine vom felinen Coronavirus (FCoV) mit monoklonalen Antikörpern

Lemmermeyer, Tanja

Diss_Tanja_Lemmermeyer.pdf (4.16 MB)

Abstract (English)

Little is known about the expression and function of the FCoV accessory proteins 3a, 3b, 3c, 7a and 7b. These proteins of FIPV strain 79-1146 were investigated in the present study. The obtained results are outlined: 1. The accessory FCoV proteins 3a, 3c and 7b were expressed in E. coli with a C-terminal his-tag. Furthermore the proteins 3a, 3b, 3c, the C-terminal half part of 3c, 7a, 7b as well as 7b without the amino acids 1 to 17 (7bdeltaSS) were expressed as fusion proteins with an N-terminal GST-tag and a C-terminal his-tag. The purification of all fusion proteins was performed by Ni2+ ion affinity chromatography under denaturing conditions. 2. To generate monoclonal antibodies the purified fusion proteins 3c and 7b were used for immunization of mice. ELISA screenings were established which enabled the identification of hybridoma cells that produce mabs against 3c and 7b. 3. The characterization of the anti-3c mabs led to the identification of regions in the C-terminus of the protein. The 3c protein could not be detected in an eukaryotic inducible expression system (Tet-on cell line BHKFIPV-3c) and also not in FCoV-infected cells. The anti-7b mabs bound within the region of amino acids 58 to 75 and reacted with a recombinant 7b fusion protein of a serotype I FCoV. 4. The expression of the 7b protein in infected cells was confirmed by western blot. An N-glycosylation site is located within the binding region. After incubation with tunicamycin the signal obtained with the anti-7b mabs was considerably stronger. Again after tunicamycin treatment the 7b protein was detected in the cytoplasm of infected cells by indirect immunofluorescence. The 7b protein colocalized partially with the ER. 5. The recombinant 7b protein was detected with all of the anti-FIPV 79-1146 sera and the ascites, but not with the anti-FECV 79-1683 sera. In contrast the recombinant fusion proteins 3a, 3b, 3c and 7a were not detected with the analyzed anti-FCoV sera.

Abstract (German)

Über Expression und Funktionen der akzessorischen Proteine 3a, 3b, 3c, 7a und 7b von FCoVs ist bislang wenig bekannt. Diese Proteine des FIPV Stamms 79-1146 wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht. Die erzielten Ergebnisse sind nachfolgend dargestellt: 1. Die akzessorischen FCoV Proteine 3a, 3c und 7b wurden mit einem C-terminalen His-Tag in E. coli exprimiert. Zudem wurden die Proteine 3a, 3b, 3c, die C-terminale Hälfte von 3c, 7a, 7b sowie 7b ohne die Aminosäuren 1-17 (7bdeltaSS) als Fusionsproteine mit einem N-terminalen GST- und C-terminalen His-Tag exprimiert. Die Reinigung der Fusionsproteine erfolgte über eine Ni2+-Ionen Affinitätschromatographie unter denaturierenden Bedingungen. 2. Die gereinigten 3c- und 7b-Fusionsproteine wurden für die Immunisierung von Mäusen zur Herstellung von mAk verwendet. Es wurden ELISA-Verfahren etabliert, mit denen anti-3c und anti-7b mAk produzierende Hybridome identifiziert wurden. 3. Die Charakterisierung der anti-3c mAk ergab, dass sie Sequenzen im C-terminalen Bereich des Proteins binden. Der Nachweis des 3c-Proteins gelang jedoch weder in einem eukaryotischen induzierbaren Expressionssystem (Tet-on Zelllinie BHKFIPV-3c) noch in FCoV-infizierten Zellen. Die anti-7b mAk detektierten den Bereich von Aminosäure 58-75; beide reagierten mit einem rekombinanten 7b-Fusionsprotein von Serotyp I FCoV. 4. Die Expression des 7b-Proteins in infizierten Zellen wurde im Western Blot bestätigt. Im Bindungsbereich befindet sich eine N-Glykosylierungsstelle. Nach Tunicamycin-Behandlung war das Signal mit den anti-7b mAk deutlich stärker. Das 7b-Protein konnte, ebenfalls nach Tunicamycin-Behandlung, mittels indirekter Immunfluoreszenz im Zytoplasma infizierter Zellen nachgewiesen werden. Das 7b-Protein kolokalisierte teilweise mit dem ER. 5. Das rekombinante 7b-Protein wurde von allen anti-FIPV 79-1146 Seren und dem Aszites detektiert, jedoch nicht von den untersuchten anti-FECV 79-1683 Seren. Die rekombinanten Fusionsproteine 3a, 3b, 3c und 7a konnten mit keinem der untersuchten anti-FCoV Seren nachgewiesen werden.