Verbreitung, Diversität und Übertragung des Mykovirus PhV und seine Auswirkung auf Plasmopara halstedii, den Falschen Mehltauerreger der Sonnenblume

Grasse, Wolfgang

Doctoral Thesis

2015

Verbreitung, Diversität und Übertragung des Mykovirus PhV und seine Auswirkung auf Plasmopara halstedii, den Falschen Mehltauerreger der Sonnenblume

Grasse, Wolfgang

Dissertation_Grasse_2015.pdf (2.41 MB)

Abstract (English)

The Plasmopara halstedii Virus (PhV) is a ss(+)RNA virus with two segments. It occurs only in its host Plasmopara halstedii, the downy mildew pathogen of the sunflower. The two RNA strands encode for an RNA depending RNA Polymerase (RdRp) and a coat protein (CP), respectively. So far the phylogenetic analysis has shown similarities of the RdRp with the family of Nodaviruses while the CP seems to belong to the family of Tombusviruses. Phylogentic comparison based on both sequences now suggest a new clade, containing PhV and the Sclerophthora macrospora Virus A, which is basal to both mentioned virus families. Studies about diversity and the occurrence of PhV have shown that the virus existed in samples from 17 countries from five continents which were collected over the past 40 years. Its presence in more than 90% of these samples was documented. No correlation was found between the geographic origin and age of the samples, and presence or absence of PhV sequences. The calculated genetic diversity among all samples was surprisingly low. For 22 fully sequenced samples from 13 countries, only 18 SNP positions were reported. Genetic distances were extremely low with means of 0.001 for the RdRp and 0.002 for the CP. Investigations of the influence of PhV on the aggressiveness and pathogenicity of P. halstedii have shown a hypovirulent effect of the virus. In this study, isogenic strains of the Oomycete were infected with PhV and used for a series of bioassays on sunflowers. The production of sporangia was lowered by ca. 30% in case of virus presence and the latent period, i.e. the day of the first observed sporulation, was delayed by one day. The potential for systemic infections of the sunflower was also lowered by one third when PhV was present. Experiments to generate PhV by means of active cDNA clones in P. halstedii were performed with two different vectors and three transformation methods. It was shown that elctroporation techniques were useful to transport plasmids into the zoospores of P. halstedii and that the T7 promotor was able to start the transcription. The following generation of sporangia, however, lacked these sequences. This indicates that there was a transient transformation which produced PhV RNA sequences, but these sequences were unable to rebuild the virus itself.

Abstract (German)

Das Plasmopara halstedii Virus (PhV) ist ein ss(+)RNA Virus mit zwei RNA Strängen, welches ausschließlich in seinem Wirt Plasmopara halstedii, dem Erreger des Falschen Mehltaus der Sonnenblume, vorkommt. Die beiden RNA Stränge kodieren zum einen für eine RNA abhängige RNA Polymerase (RdRp) und zum anderen für ein Hüllprotein (CP). Die bisherige phylogenetische Einordnung zeigte eine Verwandtschaft der RdRp mit der Familie der Nodaviren und des CP mit der Familie der Tombusviren. Berechnungen mit den kombinierten Sequenzen in dieser Arbeit legen die Einordnung in eine eigene Gruppierung, gemeinsam mit dem Sclerophthora macrospora Virus A, nahe, welche basal zu den beiden Virusfamilien liegt. Untersuchungen zur genetischen Vielfalt sowie der weltweiten Verbreitung von PhV zeigten, dass das Virus in Proben aus 17 Ländern auf fünf Kontinenten verteilt über die letzten 40 Jahre, aufzufinden ist. Hierbei konnte PhV in über 90% der getesteten P. halstedii Isolate nachgewiesen werden. Es zeigte sich dabei keine Korrelation zwischen dem geographischen Ursprung, dem Alter der Probe sowie der An- bzw. Abwesenheit des Virus. Die genetische Diversität erwies sich über alle Proben als sehr gering. Bei 22 vollständig sequenzierten Proben aus 13 Ländern konnten SNPs an 18 Positionen nachgewiesen werden. Die genetischen Distanzen betrugen 0,001 für die RdRp und 0,002 für das Hüllprotein. Experimente zum Einfluss von PhV auf die Aggressivität und Pathogenität von P. halstedii zeigten, dass das Virus einen hypovirulenten Effekt bewirkt. Bei diesen Versuchen wurden isogene Stämme von P. halstedii mit Phv infiziert und Biotests an Sonnenblumen durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass PhV die Sporangienproduktion des Oomyceten um etwa 30% mindert und das Auftreten der ersten Sporulation sich durchschnittlich um einen Tag verlängert. Auch die Fähigkeit von P. halstedii, die Sonnenblume systemisch zu infizieren, wird durch das Virus um ein Drittel reduziert. Bei Versuchen, PhV durch aktive cDNA Klone in P. halstedii zu expremieren, wurden zwei verschieden Vektoren und verschiedene Transformationssysteme miteinander kombiniert. Hierbei zeigte sich, dass die Elektroporation eine geeignete Methode zur Einbringung von Plasmiden in Zoosporen darstellt. Ebenso konnte dargestellt werden, dass der T7 Promotor in P. halstedii eine Transkriptionsaktivität aufweißt. Allerdings zeigte sich dies nicht in Nachfolgegenerationen. Daher wurden zwar PhV RNA Sequenzen gebildet, jedoch entwickelte sich hieraus kein funktionelles Virus.