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Doctoral Thesis
2018
The function of E. coli YidC for the membrane insertion of the M13 procoat protein
The function of E. coli YidC for the membrane insertion of the M13 procoat protein
Abstract (English)
The YidC/Oxa1/Alb3 family consists of insertase homologues that facilitate the insertion and folding of membrane proteins. YidC is located in the inner membrane of bacterial cells. Oxa1 is found in the inner membrane of mitochondria and Alb3 facilitates the insertion of membrane proteins in the thylakoid membranes of chloroplasts (Wang and Dalbey 2011, Hennon et al. 2015). An archaeal homologue was found in M. jannaschii showing that this insertase family is present in all domains of life (Dalbey and Kuhn 2015). The insertase family shares a structural feature that is conserved among all discovered members. This is a hydrophilic groove that is open towards the cytoplasm and the membrane core with a hydrophobic slide formed by transmembrane domain (TM) 3 and TM5. YidC functions on its own but also cooperates with the Sec translocon to facilitate the insertion of large membrane proteins. One protein that is membrane-inserted by YidC but is Sec-independent is the major coat protein of the M13 bacteriophage.
The main objectives of this work are the analysis of the insertion mechanism of M13 procoat, the major capsid protein of the M13 bacteriophage, via the YidC-only pathway and the oligomeric state of the active YidC.
The analysis of interactions between YidC and M13 procoat was performed via radioactive disulfide crosslinking mainly using copper phenanthroline as oxidizing agent. M13 procoat contacts YidC extensively in TM3 and TM5. The observed contacts suggest that the M13 procoat substrate “slides” along TM3 and TM5 of the insertase. Additional crosslinking experiments with the hydrophilic groove and the C1 loop of YidC were also performed to test their importance during the insertion process. A contact was found in the C1 loop that indicates a role in the insertion process, which is consistent with the proposed insertion model from Kumazaki et al. (2014a).
Parallel to the radioactive disulfide crosslinking, a protocol using DTNB (Bis(3-carboxy-4-nitrophenyl) disulfide, Ellman’s reagent) as the oxidizing reagent and Western blot for detection was established. This method reliably promoted the formation of crosslinking products in vivo between YidC and M13 procoat over several hours and many, but not all, mapped at the same sites as in the radioactive approach. In addition, this protocol was used to purify small amounts of a YidC-substrate complex for biochemical analysis, which could also be applied to other substrates in the future.
The oligomeric state of YidC was investigated by an artificial dimer of the insertase (dYidC) that was constructed by connecting two monomers together with a short linker. This dimer can complement YidC-depleted E. coli MK6S cells and facilitates the insertion of M13 procoat in vivo. For further analysis of the dYidC three functionally defective YidC mutants, T362A (Wickles et al. 2014), delta-C1 (Chen et al. 2014) and the 5S YidC mutant, were tested for their complementation and insertion capability. All three mutants were not able to complement under YidC depletion conditions. These mutants were then cloned in either one or both protomers of the dYidC. Complementation and insertion assays with these dYidC constructs show that in general one active protomer suffices to uphold cell viability and to facilitate the insertion of M13 procoat. Binding studies using cysteine mutants of the dYidC and M13 procoat for disulfide crosslinking with DTNB demonstrated that each protomer individually binds one substrate molecule. In summary, these experiments strongly support a monomer as the active state of the insertase for YidC-only substrates.
Taken together, this study contributes to the understanding of the insertion of proteins into the inner bacterial cell membrane.
Abstract (German)
Die YidC/Oxa1/Alb3 Proteinfamilie besteht aus Insertase-Homologen, die die Insertion und Faltung von Membranproteinen vermittelt. YidC ist dabei in der inneren Zellmembran von Bakterien lokalisiert. Oxa1 befindet sich in der inneren Membran von Mitochondrien und Alb3 vermittelt die Insertion von Membranproteinen in der Thylakoidmembran von Chloroplasten (Wang und Dalbey 2011, Hennon et al. 2015). Ein weiteres Homolog wurde im Archaeum M. jannaschii gefunden wodurch gezeigt werden konnte, dass diese Insertasefamilie in allen Domänen des Lebens konserviert ist (Dalbey und Kuhn 2015). Alle Homologe besitzen eine hydrophile Kavität als gemeinsames Strukturmerkmal. Diese Kavität ist zum Zytoplasma und zum hydrophoben Membrankern geöffnet und besitzt eine hydrophobe „Rutsche“ die von den Transmembrandomänen 3 und 5 gebildet wird. YidC ist in der Lage alleine kleine Proteine zu inserieren kann aber auch mit dem Sec Translokon zusammenarbeiten um die Insertion von großen Membranproteinen zu ermöglichen. Das Haupthüllprotein des M13 Bakteriophagen ist wiederum ein Substrat, das von YidC allein inseriert wird.
Ziele dieser Arbeit sind die Untersuchung des Insertionsmechanismus von M13 Procoat, dem Haupthüllprotein des M13 Bakteriophagen, sowie des oligomeren Zustands des aktiven YidCs.
Um die Interaktion zwischen YidC und M13 Procoat zu untersuchen wurden Disulfid-Crosslinkingexperimente mit radioaktiver Markierung der Proteine durchgeführt. Dabei kam fast ausschließlich Kupferphenanthrolin als Oxidationsmittel zum Einsatz. Es konnte gezeigt werden, dass M13 Procoat dabei sehr häufig mit den Transmembrandomänen 3 und 5 von YidC in Kontakt kommt. Die beobachteten Kontaktprofile deuten dabei auf ein „Gleiten“ von M13 Procoat entlang der hydrophoben „Rutsche“ in YidC hin. Zusätzlich durchgeführte Crosslinkingexperimente wurden in der hydrophilen Kavität und mit der C1 Schlaufe von YidC durchgeführt. Ein gefundener Kontakt auf der C1 Schlaufe zeigt, dass diese eine Rolle im Insertionsprozess spielt, was wiederum mit einem vorgeschlagenen Insertionsmodell von Kumazaki et al. (2014a) konsistent ist.
Parallel zu den radioaktiven Crosslinkingexperimenten wurde ein neues Protokoll etabliert bei dem DTNB 5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) als oxidierendes Reagenz zum Einsatz kommt. Die Detektion der Signale erfolgt hierbei über Western Blots und Immundetektion. Mit dieser Methode konnte über mehrere Stunden zuverlässig die Bildung der Protein-Protein Komplexe aus YidC und M13 Procoat in lebenden E. coli Zellen vermittelt werden. Dabei konnten fast alle detektierten Kontaktstellen aus den radioaktiven Versuchen ebenfalls nachgewiesen werden. Zusätzlich kam dieses Protokoll auch bei der Reinigung von kleinen Mengen des YidC-M13 Procoat Komplexes zum Einsatz und kann möglicherweise auch auf andere Substrate angewendet werden.
Der oligomere Zustand von YidC wurde mit einem künstlichen Dimer der Insertase (dYidC) untersucht. Dieses besteht aus zwei YidC Molekülen die über einen kurzen Linker miteinander verbunden sind. Es ist in der Lage YidC-depletierte E. coli MK6S Zellen zu komplementieren und zudem M13 procoat in die innere Membran zu inserieren. Für die weitere Untersuchung des dYidCs wurden drei funktionell defekte YidC-Mutanten, T362A (Wickles et al. 2014), delta-C1 (Chen et al. 2014) und die 5S YidC Mutante, auf ihre Fähigkeit zu komplementieren und zu inserieren getestet. Keine der getesteten Mutanten war in der Lage das Zellwachstum unter Depletionsbedingungen zu ermöglichen und wurden nachfolgend in eines oder in beide Protomer des dYidCs kloniert. Über Komplementations- und Insertionsstudien mit diesen dYidC Konstrukten konnte gezeigt werden, dass ein aktives Protomer an sich ausreicht um zu komplementieren und M13 Procoat zu inserieren. Bindungsstudien mit Cysteinmutanten des dYidCs und M13 Procoat, welche mittels DTNB komplexiert wurden, zeigten zudem, dass jedes Protomer für sich ein Substratprotein bindet. Die in dieser Studie durchgeführten Experimente zeigen, dass ein Monomer die aktive Konfiguration der Insertase darstellt, welche die Insertion von YidC-abhängigen Substraten vermittelt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der Insertion von Proteinen in die innere Bakterienzellmembran bei.
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Faculty of Natural Sciences
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Institute for Microbiology
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2017-12-05
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English
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Classification (DDC)
570 Biology