Influence of the newly identified Mos10 interaction partner Vps68on ESCRT-III function

Alsleben, Sören

Doctoral Thesis

2021

Influence of the newly identified Mos10 interaction partner Vps68on ESCRT-III function

Alsleben, Sören

Diss_Soeren_Alsleben.pdf (24.74 MB)

Abstract (English)

The endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) is a part of the heteromeric complex machinery consisting of ESCRT-0, -I, -II, and -III ensuring functional protein traffic of endocytic and biosynthetic cargo. Stepwise sorting of labeled cargo material inside the lumen of the endosome by invagination and abscission of the endosomal membrane to form intraluminal vesicles (ILV’s) is mediated by the ESCRT-III complex. The complex consists of eight members of which Vps20, Snf7, Vps2, and Vps24 are considered ESCRT-III essential subunits, and Chm7, Did2, Ist1, and Mos10/Vps60 are commonly labeled as complex associated proteins. The correct interplay between the proteins ensures cargo sorting into the MVB (multivesicular body) pathway and transport from the late endosome into the vacuolar lumen for degradation. Besides the initial function of vacuolar protein sorting (vps), the complex is involved in a multitude of cellular processes like cell abscission, virus budding, autophagy, and remaining nuclear envelope integrity. The step-wise assembly of the ESCRT-III complex is mediated after the cascade-like ESCRT-0 to ESCRT-II complex formation at the membrane budding site, collecting cargo protein for invagination into the endosomal lumen. ESCRT-III Vps20 is recruited to the membrane by the ESCRT-II member Vps25, then nucleating Snf7 association and oligomerization. Additional assembly of ESCRT-III members like Vps24 and Vps2 further drives membrane bending away from the cytosol to the final abscission event, before being recycled back to cytosolic monomers by Vps4. Although Mos10 has been implicated in the recycling step of the ESCRT-III units by interacting with the Vps4/Vta1 complex, the protein’s function remains poorly characterized. This thesis tried to find new insights in Mos10 functionality by finding yet uncharacterized interacting partners, thus connecting the protein to new putative non-endosomal functions or understanding its role in the established ESCRT-III complex. For this purpose, a series of crosslinking experiments with tagged variants of Mos10 were performed. Purification was achieved by IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) after adding a poly-his sequence to the protein and by immunoprecipitation of sfGFP tagged Mos10. Both methods revealed a multitude of putative Mos10 interacting partners by MS analysis to be further reduced by applying the SILAC (stable isotope labeling with amino acids in cell culture) technique. After selecting possible Mos10 interacting partners, IP and Co-IP experiments of tagged candidate variants were used to identify an interaction between the two proteins. An interaction between Mos10-6His and Vps68-13myc besides native Mos10 and Vps68-fGFP could be verified by purification of Vps68 and co-precipitating Mos10. The influence of Vps68 on the assembly and composition of the ESCRT-III complex was examined. After Vps68 depletion, an enrichment of the core subunits Snf7, Vps2, and Vps24 in the complex was detected with a reduced number of Did2, Ist1, and Mos10 molecules. Thus, it appears that ESCRT-III disassembly is blocked in ∆vps68 mutant. The influence of VPS68 deletion on the intracellular localization of ESCRT-III proteins was examined by fluorescence microscopy with sfGFP-tagged variants. While the localization of most ESCRT-III proteins was not significantly altered, a marked relocalization was observed for Mos10. In wildtype, Mos10-sfGFP was localized at the vacuolar membrane, while in ∆vps68 it was dispersed into vesicular structures enriched at the cell cortex. Further, the impact of VPS68 deletion on the sorting of the endocytic cargo protein Ste6 was investigated. By cycloheximide chase experiments, it could be shown that Ste6 is strongly stabilized in a ∆vps68 mutant. This indicates that the transport of the protein to the yeast vacuole for degradation is blocked. The ∆vps68 block in endocytic trafficking was compared with other mutants of the vps-pathway, whose site of action has been established. These experiments show that the VPS68 deletion neither leads to a class D phenotype, as in ∆vps21, nor to a class E phenotype, as in ∆snf7. The Ste6-GFP distribution in the ∆vps68 mutant rather resembles wildtype with more pronounced accumulation of endosomal dots. The data taken together suggest that Vps68 acts after the formation of the ESCRT-III complex and is required for cargo delivery from the late endosome to the vacuolar lumen.

Abstract (German)

Der für den endosomalen Protein-Transport erforderliche ESCRT (endosomal sorting complex required for transport)-III Komplex ist ein Teil der heteromeren Komplexmaschinerie, die aus ESCRT-0, -I, -II und -III besteht und die Sortierung von endozytischem und biosynthetischem Cargo in intraluminäre Vesikel (ILVs) bewerkstelligt. Der ESCRT-III Komplex besteht aus acht Mitgliedern, von denen Vps20, Snf7, Vps2 und Vps24 als essentielle Untereinheiten des ESCRT-III-Komplexes angesehen werden, während Chm7, Did2, Ist1 und Mos10/Vps60 gemeinhin als komplexassoziierte Proteine bezeichnet werden. Das korrekte Zusammenspiel der Proteine gewährleistet die Sortierung des Cargos in den MVB (multivesicular body)-Weg und den Transport aus dem späten Endosom in das vakuoläre Lumen zur Degradation. Neben der ursprünglichen Funktion der vakuolären Proteinsortierung (vps) ist der Komplex an einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Zellteilung, Virusknospung, Autophagozytose und Aufrechterhaltung der Kernhüllenintegrität beteiligt. Der schrittweise Aufbau des ESCRT-III-Komplexes erfolgt kaskadenartig beginnend mit ESCRT-0- bis zu ESCRT-II an der Knospungsstelle der Membran und sammelt das Cargo-Protein für die Einschleusung in das endosomale Lumen. Das ESCRT-III Protein Vps20 wird durch die ESCRT-II-Untereinheit Vps25 an die Membran rekrutiert, wodurch die Assoziation und Oligomerisierung von Snf7 ausgelöst wird. Weitere ESCRT-III-Mitglieder wie Vps24 und Vps2 sorgen dafür, dass sich die Membran bis zur endgültigen Abtrennung der ILVs vom Zytosol zum Lumen hin verbiegt. Sodann wird der Komplex durch Vps4 wieder aufgelöst. Mos10 wird eine Funktion bei der Auflösung der ESCRT-III Komplexe über den Vps4/Vta1 Komplex zugesprochen, doch ist die Funktion des Proteins nach wie vor unzureichend geklärt. In dieser Arbeit wurde durch Identifizierung bislang nicht charakterisierter Interaktionspartner versucht, neue Einblicke in die Funktionalität von Mos10 zu gewinnen, um einerseits Verbindungen zu neuen nicht-endosomalen Funktionen herzustellen oder auch, um andererseits seine Rolle im etablierten ESCRT-III Komplex besser zu verstehen. Dazu wurden eine Reihe von Quervernetzungsexperimenten mit markierten Varianten von Mos10 durchgeführt. Die Reinigung erfolgte durch IMAC (Immobilisierte Metallionen-Affinitäts-Chromatographie) nach Hinzufügen einer Poly-his-Sequenz zum Protein und durch Immunpräzipitation von sfGFP-markiertem Mos10. Beide Methoden ergaben eine Vielzahl von möglichen Interaktionspartnern von Mos10 durch MS-Analyse, die durch Anwendung der SILAC-Technik (Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture) weiter reduziert werden konnte. Nach der Auswahl möglicher Mos10-Interaktionspartner wurden IP- und Co-IP-Experimente an markierten Kandidatenvarianten durchgeführt, um eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen zu identifizieren. Eine Interaktion zwischen Mos10-6His und Vps68-13myc konnte neben nativem Mos10 und Vps68-fGFP durch Aufreinigung von Vps68 und Ko-Präzipitation von Mos10 nachgewiesen werden. Der Einfluss von Vps68 auf den Aufbau und die Zusammensetzung des ESCRT-III Komplexes wurde untersucht. Es zeigte sich, dass in der VPS68 Deletionsmutante die Core-Untereinheiten Snf7, Vps2 und Vps24 im Komplex angereichert waren, während die ESCRT-III assoziierten Protein Did2, Ist1 und Mos10 abgereichert waren. Das deutet darauf hin, dass die Auflösung des ESCRT-III Komplexes in der ∆vps68-Mutante blockiert ist. Der Einfluss der VPS68-Deletion auf die intrazelluläre Lokalisierung der ESCRT-III-Proteine wurde durch Fluoreszenzmikroskopie mit sfGFP-markierten Varianten untersucht. Während die Lokalisation der meisten ESCRT-III-Proteine nicht signifikant verändert war, wurde für Mos10 eine deutliche Relokalisation beobachtet. Im Wildtyp war Mos10-sfGFP an der Vakuolenmembran lokalisiert, während es in ∆vps68 in vesikulären Strukturen verteilt war, die am Zellkortex angereichert waren. Außerdem wurde untersucht, wie sich die Deletion von VPS68 auf die Sortierung des endozytischen Cargo-Proteins Ste6 auswirkt. Durch Cycloheximid-Chase-Experimente konnte gezeigt werden, dass Ste6 in einer ∆vps68-Mutante stark stabilisiert ist. Dies deutet darauf hin, dass der Transport des Proteins in die Hefevakuole zum Abbau blockiert ist. Die ∆vps68-Blockade des endozytischen Transports wurde mit anderen Mutanten des vps-Wegs verglichen, deren Wirkort bereits bekannt ist. Diese Experimente zeigen, dass die Deletion von VPS68 weder zu einem Klasse-D-Phänotyp, wie bei ∆vps21, noch zu einem Klasse-E-Phänotyp, wie bei ∆snf7, führt. Die Ste6-GFP-Verteilung in der ∆vps68-Mutante ähnelt eher dem Wildtyp mit einer ausgeprägteren Akkumulation von endosomalen Punkten. Die Daten deuten darauf hin, dass Vps68 nach der Bildung des ESCRT-III-Komplexes wirkt und dass es für den Transport von Cargo-Proteinen aus dem späten Endosom in das Vakuolen-Lumen benötigt wird.