English Title: Preparation and Characterization of Ultrathin and Biocompatible Films and Membranes based on Poly(ethylene glycols)

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Abstract

Motivation dieser Arbeit ist die Präparation ultradünner Nanomembranen (< 10 nm), die außerdem biokompatibel bzw. proteinresistent sind, um als Trägerfilm biologischer Proben für die hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) Verwendung finden zu können. Als Basis werden selbstaggregierende Monolagen (SAMs) aus 4‘-Nitrobiphenyl-4-thiol (NBPT) auf einem Au(111)-Substrat eingesetzt, die durch Bestrahlung mit niederenergetischen Elektronen lateral quervernetzt und deren terminale Nitrogruppen zu oberflächengebundenen Aminogruppen reduziert werden (iNBPT). An diese lassen sich Epoxid-terminierte Polyethylenglykole (PEG) derart koppeln, dass die resultierende PEG-iNBPT Doppelschicht bei einer Gesamtdicke von nur 5 nm biokompatibel wird und der Adsorption von Fibrinogen als Testprotein widersteht. Ferner wird ellipsometrisch und röntgenspektroskopisch (X-ray photoelectron spectroscopy, XPS) untersucht, welchen Einfluss Schichtdicke und Packungsdichte des PEG-Films auf die proteinabweisenden Eigenschaften des PEG-iNBPT-Films ausüben und die Resultate mit denen eines etablierten, biokompatiblen SAMs aus Oligoethylenglykol-terminiertem Undecanthiol verglichen. Zuletzt muss der PEG-iNBPT Film vom Substrat abgelöst und als Membran über ein TEM-Grid mit freistehenden Bereichen von mindestens 10 x 10 µm² gespannt werden können, ohne dass die Folie dabei ihre Biokompatibilität verliert. Ihre Eignung als HRTEM-Trägerfilm wird anhand von Gold-Nanopartikeln und dem Eisenspeicherprotein Ferritin demonstriert. Wegen der vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten von NBPT-SAMs wäre es interessant, ein alternatives SAM-bildendes System mit ähnlichen Merkmalen zu besitzen. In einer führen Arbeit wurde bereits aufgeführt, dass 4‘-Cyanobiphenyl-4-thiol (CBPT) Monolagen ebenfalls durch Elektronenbestrahlung quervernetzt und die terminale Nitrilgruppe zu einer Aminogruppe reduziert wird. Darauf aufbauend wird in dieser Arbeit gezeigt, dass sich CBPT-SAMs als negatives Resist-Material in Elektronenstrahllithographie, sowie als Templat in der chemischen Elektronenstrahllithographie (EBCL) eignen. In diesem Zusammenhang wird der Einfluss der Elektronenenergie im Bereich von 0.5   10 keV auf den Grad der Quervernetzung aromatischer SAMs sowie auf die Effektivität der Reduktion terminaler Gruppen beleuchtet, um so Aufschlüsse über zugrundeliegende Prozesse bei der Elektronenbestrahlung selbstaggregierender Monolagen zu gewinnen. Außerdem wir der Frage nachgegangen, ob alle durch elektronenstrahlinduzierte Reduktion entstandenen, oberflächengebundenen Aminogruppen gleichermaßen in der Lage sind, als Anker zur Kopplung weiterer Moleküle zu dienen. Die SAM-basierenden, PEGylierten Nanomembranen sind mit 5 nm zwar außerordentlich dünn, aber nur einseitig biokompatibel. Es wird in dieser Arbeit eine zweite Präparationsmethode vorgestellt, die es ermöglicht, direkt und ohne den Umweg über quervernetzte SAMs, doppelseitig biokompatible Nanomembranen variabler Dicke herzustellen, die ab 20 nm ausreichend mechanische Stabilität aufweisen, um freistehend existieren können. Als Vorstufe dient ein aus Epoxid- und Amino-terminierten, multifunktionellen Polyethylenglykolen bestehender Zweikomponentenfilm, der per Rotationsbeschichtung auf ein flaches Substrat aufgebracht und thermisch quervernetzt wird. Die 6 - 300 nm dicken PEG-Filme werden ellipsometrisch sowie XPS- und infrarotspektroskopisch charakterisiert und auf ihre filmdickenanhängige Proteinresistenz untersucht. Durch die Quervernetzung zeigt das polymere Netzwerk ein Hydrogel-typisches, reversibles Quellverhalten beim Kontakt mit Wasser, welches eingehend ellipsometrisch analysiert wird. Zudem können Gold-Nanopartikel (AuNPs) irreversibel und in hohen Dichten in der Matrix des PEG-Films immobilisiert werden und so das Quellverhalten in eine optische Antwort des Systems umwandeln. Ein zweiter Aspekt bezüglich der PEG-Filme betrifft ihre Reaktion auf die Bestrahlung mit Elektronen. Das Verhalten von Polyethylenglykolen wird diesbezüglich erstmals systematisch mit Hilfe der PEG-Filme XPS- und infrarotspektroskopisch sowie mit Röntgen-Nahkanten-Absorptions-Spektroskopie (NEXAFS) untersucht. Ferner wird rasterkraftmikroskopisch (AFM) und fluoreszenzmikroskopisch ermittelt, wie sich die dosisabhängige Elektronenbestrahlung auf die PEG-Filme in Bezug auf Quellverhalten, Topographie, Benetzbarkeit und Biokompatibilität auswirken. Zuletzt werden die PEG-Filme von ihrem Substrat abgehoben, freistehend über eine Gitterstruktur gespannt und die mechanischen Eigenschaften wie Elastizitätsmodul und Eigenspannung der Membranen bestimmt. Auch in diese können Gold-Nanopartikel eingebettet werden und somit eine Verbundmembran mit erweiterten optischen Eigenschaften hergestellt werden. Sie zeigt zudem ebenfalls ein ausgeprägtes Quellverhalten, welches zu veränderten Eigenschaften in Abhängigkeit von äußern Parametern wie Temperatur oder Luftfeuchtigkeit führt.

Translation of abstract (English)

The motivation behind this work is the preparation of ultrathin nanomembranes (< 10 nm), which should be additionally biocompatible or protein-repelling to be used as supporting film for high-resolution transmission electron microscopy (HRTEM) studies of biological samples. It may improve essentially the resolution and structural reliability of such experiments in their specific application to sensitive biological targets. As a basis for preparation, self-assembled monolayers (SAMs) of 4'-nitrobiphenyl-4-thiol (NBPT) on Au(111) substrates are used. In the first step, NBPT SAMs are cross-linked by low-energy electron exposure resulting in a mechanically stable film. Simultaneously, the terminal nitro groups are reduced to reactive amine moieties to which epoxy-functionalized poly(ethylene glycols) (PEGs) are coupled. The resulting PEG-iNBPT bilayer with a total thickness of only 5 nm resists the adoption of fibrinogen as a test protein. Further, layer thickness and package density of the PEG-moiety is monitored by ellipsometry and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) to investigate the influence on protein-repellent properties of the PEG-iNBPT film. The results are compared with those of established biocompatible SAMs of oligo(ethylene glycol)-terminated undecanethiol. Finally, the PEG-iNBPT film is separated from its substrate and transferred to a TEM grid with freestanding areas of at least 10 x 10 µm² without losing biocompatibility. The suitability as HRTEM supporting film is demonstrated using gold nanoparticles and the iron storage protein ferritin. Due to the versatile applications of NBPT SAMs, it would be valuable to have a second SAM-building system with similar characteristics. In a previous work was already shown that SAMs of 4'-cyanobiphenyl-4-thiol (CBPT) are cross-linked by electron exposure and the terminal nitrile group is converted into an amino moiety. On this basis, in this work is demonstrated that CBPT SAMs are suitable as a negative resist material in electron beam lithography, as well as a template in the electron beam chemical lithography (EBCL). In this context, the influence of the electron energy in the range of 0.5   10 keV is investigated concerning the degree of crosslinking of aromatic SAMs as well as the efficiency of the reduction of the terminal groups. Through this, one receives information about the underlying processes involved in the electron irradiation of self-assembled monolayers. In addition, the question is investigated whether all surface-bound amino groups formed by electron beam induced reduction are equally capable of acting as an anchor group for other molecules. PEGylated nanomembranes on a basis of cross-linked SAMs are extremely thin but they only offer a single-side biocompatibility. In this work a second preparation technique is presented which allows double-sided biocompatible nanomembranes in arbitrary thickness directly and without having to use cross-linked SAMs. Above 20 nm, they have sufficient mechanical stability to be free-standing. As precursors, epoxy- and amino-terminated, multi-functional poly(ethylene glycols) (PEGs) are applied as a two-component film by spin coating on a flat substrate and are thermally cross-linked subsequently. PEG films between 6 - 300 nm thicknesses are prepared and characterized by ellipsometry, XPS and infrared spectroscopy as well as their thickness dependent protein-repellence is evaluated. By the cross-linking procedure, the polymeric network exhibits a hydrogel-like, reversible swelling behavior upon contact with water, which is analyzed in detail by ellipsometry. Additionally, gold nanoparticles (AuNPs) are irreversibly immobilized and in high densities in the PEG matrix of the films to transfer the swelling behavior into an optical response of the film. For the first time, the behavior of poly(ethylene glycols) in respect to their reaction toward irra-diation with electrons is systematically investigated using XPS, infrared spectroscopy and near edge X-ray-absorption spectroscopy (NEXAFS). Furthermore, atomic force microscopy (AFM) and fluorescence microscopy are used to determine the dose-dependent effect of electron exposure on the PEG films in terms of swelling behavior, topography, wettability and biocompatibility. Finally, the PEG-films are detached of their substrate and tightened over a grating structure to determine the mechanical properties of the membranes with the bulge test. Also gold nanoparti-cles can be embedded in the membrane producing a composite membrane which offers enhanced optical properties. The membrane shows a distinct swelling, which expresses altered properties as a function of parameters such as temperature or humidity.