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Abstract

Transportstudien für Efflux-Transporter sind in der pharmazeutischen Industrie weit verbreitet und dienen dazu potentielle Arzneimittel als Substrate von Efflux-Transportern zu identifizieren. Diese verhindern, dass u.a. therapeutisch wirksame Mengen von Arzneistoffen ihren Wirkort erreichen. Von besonderer Bedeutung sind dabei, auf Grund ihres breiten Substratspektrums, die beiden ABC-Transporter P-Glykoprotein (Pgp, MDR1) und Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2). Die Madin-Darby canine kidney Zelllinie (MDCK) und ihre, mit einem humanen Transportprotein stabil transfizierten Varianten (MDCK-MDR1, MDCK-BCRP), werden vielfach als in vitro Zellkulturmodelle für diese Transportstudien verwendet. Die Wildtyp MDCK-Zelllinie dient bei Experimenten als Kontrollpopulation, da es zwischen dem endogen exprimierten Transporter und der humanen, transfizierten Proteinvariante zu Substratinteraktionen kommt. Aus diesem Grund ist es wichtig, sich auf konstante und vergleichbare Expressionslevel der Zelllinien hinsichtlich der Transportproteine verlassen zu können, um falsch negative oder falsch positive Ergebnisse bei der Identifikation von Substraten zu vermeiden. Aus der MDCK-MDR1 und der MDCK-BCRP Zellpopulation wurden Einzelzellen präparativ sortiert, um eine neue homogene Population mit hoher und stabiler Expression des transfizierten, humanen Gens zu generieren. Gleichzeitig wurden Einzelzellen der Wildtyp-Populationen sortiert, um eine Kontrollzellinie mit verminderter Expression des endogenen Genproduktes zu erhalten, welche mit der Expression in den zuvor gewonnen Einzellzellpopulationen vergleichbar ist. Die generierten Zellpopulationen wurden molekularbiologisch mittels qRT-PCR und Western Blot analysiert und bestätigten den Erfolg des Versuchsziels. In Ergänzung dazu wurden durch funktionelle Transportversuche mit radioaktiv markierten Substraten von Pgp die gewonnenen Erkenntnisse verifiziert. Darüber hinaus wurden die Zelllinien hinsichtlich der Expression weiterer ABC-Transporter sowie Transporter aus der Gruppe der Organic Anion und Organic Cation Transportproteine näher charakterisiert, um ein tieferes Verständnis für die Transportvorgänge und mögliche Interaktionen in Transportstudien zu erhalten. Um vergleichbare Zelllinien mit möglichst geringer Expression des endogenen Pgp zu generieren, wurden Populationen der MDCK, MDCK-MDR1 und MDCK-BCRP Zellen mit Zinkfinger Nukleasen (ZFN) behandelt, um cPgp auf genomischer Ebene zu deletieren. Auch hier wurden Einzelzellen zur Etablierung einer homogenen knockout (KO) Population sortiert. Die generierten KO-Zelllinien wurden molekularbiologisch charakterisiert und auf ihre Transporteigenschaften bezüglich Pgp, insbesondere in der betriebsinternen Transportversuchsanordnung von AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG, untersucht. Die KO-Zellen konnten verbesserte Werte für Pgp-Refernzsubstrate im Transportversuch aufweisen und auch für betriebsinterne Substanzen, im Vergleich zu den Ausgangkulturen, verlässliche Ergebnisse erziehlen.