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PDF, English - main document Download (16MB) | Lizenz: Identification of novel tumor-associated immune modulators using a high-throughput RNAi screen by Khandelwal, Nisit underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 3.0 Germany

Abstract

Immune surveillance by T cells is an important component of body’s defense against infection and disease, whereas the peripheral immune tolerance is important for defense against self-reactive T cells. The fine balance between the two is skewed in cancer, whereby the tumors exploit the immune tolerance mechanisms to escape recognition and elimination by the cytotoxic T lymphocytes (CTLs). One of the major routes of immune resistance of tumor cells is mediated by cell surface bound ligands that engage immune-inhibitory receptors on T cells. Targeting these immune-checkpoint ligands that inhibit immune rejection, e.g. via blocking antibodies, can restore immune surveillance and increase the efficacy of cancer immunotherapy. However, only a few such targets have been identified so far.

The aim of this thesis was to establish a high-throughput screening assay that enables a rapid and comprehensive identification of cell surface genes with immune modulatory function in selected tumors. To this end, a tumor cell-T cell co-culture assay was established which combines siRNA-based gene knockdown with a luciferase-based assessment of T cell-mediated tumor cell killing. Applied to three independent parallel screens, this study uncovered a repertoire of novel and robust immune modulatory ligands on breast cancer cells that are also abundantly expressed by other cancer types. Amongst them, CCR9 was functionally validated as a strong inhibitor of T cell function and suppressor of T cell reactivity against breast cancer, malignant melanoma and pancreatic cancer. Knockdown of CCR9 resulted in increased tumor susceptibility towards immune lysis by antigen-experienced T cells along with the increased production of effector cytokines and cytolytic enzymes. CCR9-induced gene expression changes in the encountering T cells were consistent with an enhanced effector T cell phenotype. Mechanistically, CCR9 regulated T cell effector function through differential activation of the STAT signaling pathways, thereby representing a unique example of an alternative, TCR-independent route for effective immune suppression induced by a cell surface molecule.

Additionally, the in vivo relevance of targeting CCR9 for adoptive cancer immunotherapy was explored in this study. Taken together, this study describes a rapid, high-throughput, siRNA-based screening approach that allows a comprehensive identification of immune-modulatory genes which, as an entity, represents the ‘immune modulatome’ of cancer. Screening additional tumor types for their immune modulatory signatures would help in uncovering additional targets for therapeutic inhibition.

Translation of abstract (German)

T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Pathogenen und Krankheiten, die periphere Toleranz hingegen schützt vor selbst-reaktiven T-Zellen. Das Gleichgewicht zwischen diesen beiden Mechanismen ist bei Krebserkrankungen gestört und der Tumor nutzt die Mechanismen der peripheren Toleranz, um der Erkennung und Eliminierung durch zytotoxische T-Zellen zu entgehen. Einen der wichtigsten Mechanismen stellen dabei Liganden auf der Zelloberfläche der Tumorzellen dar, die inhibitorische Rezeptoren auf T-Zellen binden. Ein Blocken dieser immune-checkpoint- Liganden, zum Beispiel mittels Antikörpern, kann das Erkennen des Tumors durch das Immunsystem wiederherstellen und die Effizienz von Immuntherapien erhöhen. Bisher wurden nur wenige dieser Liganden identifiziert.

Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Entwicklung eines Hochdurchsatz-Screens zur schnellen und umfassenden Identifizierung von Molekülen mit immunmodulierender Wirkung auf der Oberfläche von Krebszellen. Zu diesem Zweck wurde die Kokultur von Tumorzellen und T-Zellen mit einem siRNA basiertem knockdown kombiniert. Das Töten der Tumorzellen durch die T-Zellen wurde dabei mit einem Luciferase-Assay gemessen. Mit Hilfe dieser Methode wurden in drei voneinander unabhängigen Screens neue immunmodulierende Liganden auf Brustkrebs-Zellen gefunden, die jedoch auch auf anderen Tumorentitäten überexprimiert sind. Von den Liganden wurde CCR9 als ein starker Inhibitor der T-Zell Antwort gegen Zellen aus Brustkrebs, malignem Melanom und Pankreaskarzinom funktional validiert. Der knockdown von CCR9 führt zu einer größeren Empfänglichkeit der Tumorzellen gegenüber einer Lyse durch Antigen-erfahrene T-Zellen sowie zu einer erhöhten Produktion von Effektor-Zytokinen und lytischen Enzymen der T-Zellen. Eine Genexpressions-Analyse der T-Zellen zeigt einen verstärkten Effektor-Phänotyp nach knockdown von CCR9 in den Krebszellen. Mechanistisch reguliert CCR9 die T-Zell Effektor-Funktionen über die differenzielle Aktivierung von STAT-Signalwegen. Dies stellt einen alternativen, von Oberflächenmolekülen aktivierten Suppressions-Mechanismus dar, der vom Signalweg des T-Zellrezeptors unabhängig ist. Zusätzlich wurde die Relevanz von CCR9 für eine adoptive Immuntherapie in vivo untersucht.

Diese Arbeit beschreibt einen Hochdurchsatz-Screen zur umfassenden Identifikation von immunmodulierenden Molekülen, die in ihrer Gesamtheit das „Immun-Modulatom“ von Krebs darstellen. Die Untersuchung der immunmodulierenden Signatur weiterer Tumorentitäten kann zusätzliche Ziele für eine verbesserte Immuntherapie hervorbringe.