English Title: Protective effects of the ER chaperone GRP78 against doxorubicin cardiotoxicity

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Abstract

Das Anthrazyklin Doxorubizin ist eines der am häufigsten verwendeten Chemotherapeutika. Es wird allerdings in seiner Anwendung durch seine Kardiotoxizität, mit der Gefahr der Entwicklung einer ernsten Herzinsuffizienz, eingeschränkt. Da bislang nur eine symptomatische Therapie der Doxorubizinkardiomyopathie möglich ist, liegt der Fokus auf der Vermeidung hoher Doxorubizindosen. Die einzige präventive Therapie ist für ein großes Patientenkollektiv, Kinder und Jugendliche, nicht geeignet. Daher müssen neue Strategien für eine Protektion des Herzens gegenüber Doxorubizin gefunden werden. Einen interessanten Ansatz bietet hier die Übertragung natürlicher Resistenzmechanismen von Tumoren in eine kardiale Therapie. Das Chaperon "Glukose Reguliertes Protein 78" (GRP78) ist in vielen Tumoren hochreguliert und wird dort mit der Resistenz gegen Anthrazykline in Verbindung gebracht. Ziel der vorgelegten Arbeit war daher, das protektive Potenzial einer spezifischen, durch Adeno-assoziierte Viren vermittelten Überexpression von GRP78 gegenüber Doxorubizin im Herzmuskel zu untersuchen. Dafür wurden klinisch relevante in vivo und in vitro Modelle der Doxorubizinkardiotoxizität etabliert. Im in vitro Modell zeigte sich die Doxorubizinkardiotoxizität durch eine erhöhte Aktivierung von Apoptose. Im Zusammenhang mit der Toxizität war eine Akkumulation von p53 und die Aktivierung der "Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II" (CaMKII) zu beobachten, was auf die durch Doxorubizin induzierte DNA-Schädigung und Störungen der Ca2+-Homöostase zurückzuführen ist. Analog konnten im Mausmodell nach der Doxorubizinbehandlung erhöhte Werte des kardialen Zelltodmarkers TroponinT (hsTnT) sowie eine beginnende kontraktile Dysfunktion festgestellt werden. Durch die Überexpression von GRP78 sank in vitro sowohl die Apoptose, als auch die p53 Akkumulation und die Aktivierung der CaMKII. Im in vivo Modell war die GRP78 Überexpression mit niedrigeren hsTnT-Leveln und einer signifikanten Verbesserung der Relaxation des Ventrikels verbunden. Darüber hinaus war eine deutliche Verlängerung des Gesamtüberlebens zu beobachten. In dieser Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass eine kardiale Überexpression von GRP78 die Doxorubizinkardiotoxizität in vitro und in vivo verringert. Der protektive Effekt konnte über p53 und CaMKII mit der Regulation der Antwort auf DNA-Schädigung bzw. der Ca2+-Homöostase in Verbindung gebracht werden. Damit stellt diese Arbeit auch erstmals Hinweise auf einen Einfluss von GRP78 auf CaMKII-Aktivität vor und eröffnet zudem Möglichkeiten für neue präventive Maßnahmen und ein besseres Verständnis der Doxorubizinkardiotoxizität.

Translation of abstract (English)

The Anthracycline Doxorubicin is one of the most widely prescribed chemotherapeutics. However, its use is limited by its cardiotoxicity with the threat of developing cardiomyopathy. As therapeutic options so far are limited to a mere symptomatic treatment, the focus lies on reduction of the cumulative Doxorubicin dose. The only protective therapy is not suited for a large patient collective - children and youths. Therefore novel strategies for the protection of the heart against Doxorubicin have to be developed. An interesting approach is the translation of natural anthracycline resistance mechanisms from the tumour to cardiac therapy. The ER chaperone "Glucose Regulated Protein 78" (GRP78) is upregulated in many tumours and seems to protect them from anthracycline treatment. The aim of this thesis therefore was to investigate the protective potential of a cardiac specific viral GRP78 overexpression in clinically relevant in vitro and in vivo models of Doxorubicin cardiotoxicity. In the in vitro model, Doxorubicin cardiotoxicity was shown by high levels of apoptosis. Doxorubicin cardiotoxicity was also characterized by the accumulation of p53 and the activation of "Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II" (CaMKII), which is connected to Doxorubicin induced DNA damage and disturbed Ca2+ homeostasis. In line with these findings the Doxorubicin treated mice in the in vivo mouse model had elevated levels of the cardiac cell death marker TroponinT (hsTnT) and developed early signs of a contractile dysfunction. With GRP78 overexpression the p53 levels and CaMKII activation were diminished in vitro, as was apoptosis. In vivo GRP78 overexpression led to a reduction of hsTnT plasma levels and a significant improvement of ventricular relaxation. In addition, a pronounced prolongation of overall survival was observed. In conclusion, this thesis contains the first ever proof, that cardiac overexpression of GRP78 protects from Doxorubicin cardiotoxicity in vitro and in vivo. With changes in p53 levels and CaMKII activation the protective effect could be connected to the regulation of DNA damage response and Ca2+-homeostasis. This thesis also was able to present first time evidence for GRP78 influencing CaMKII activity. Thus, these findings open up new possibilities for preventive strategies and the understanding of Doxorubicin cardiotoxicity.