German Title: Studien zur Entstehung von Resistenzen in P. falciparum Malaria in vivo und in vitro

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Abstract

The global burden of Malaria remains high with a 2.2 billion people estimated to live in endemic areas (Snow et al, 2005). Prompt and efficacious chemotherapy remains an important cornerstone in the fight against malaria. Development of resistance is the parasite’s mechanisms to respond to massive drug pressure. In this study I analysed drug-parasites interactions in vivo and in vitro using discreet experimental approaches. I started by studying parasite survival in vivo, 7 days after treatment intervention. In the following, I analysed parasites isolates in vitro that had been exposed to various drugs over the last years in the community. In the final part of the project, I attempted to gain insight in the evolution of drug resistance in vitro. For this work, I set up induction of resistance experiments in vitro and analysed in a time course mechanisms of resistance. Of particular interest was here the relationship between gene amplification and the emergence of single nucleotide polymorphisms. The results presented in this work show that 7 days after start of treatment (artemisinin combination therapy or amodiaquine) subpatent parasite populations were detected in 64/156 patients (41%) with high sensitivity. However, persistence of parasites was not associated with recrudescent infection at the individual level but showed instead correlation with initial parasite density in potentially less immune patients. Analysis of field isolates revealed high prevalence of anti-folate resistance due to triple and double mutant Pfdhfr. In theses parasites, no gene copy number variations were detected for genes involved in the folate pathway. However, induction of pyrimethamine resistance in vitro, lead to Pfdhfr amplification in two laboratory strains 3D7 (31 fold) and FCR3 (9 fold) associated with high cross-resistance to cycloguanil and trimethoprim but not to chloroquine. Further, I was able to identify gene amplification as a mechanism for acquisition of S108N in Pfdhfr. My findings of persistent subpatent parasitaemia after treatment underline the need of understanding clearance rate, persistence and elimination of parasites after anti- malarial treatment, particularly in regard to recent reports of emerging artemisinin resistance in western Cambodia (Dondorp et al, 2009), My results also suggest that resistant phenotypes may persist in parasite populations, once introduced. And finally, my data suggest gene amplification as an intermediate step in the acquisition of resistance conferring point mutations in P. falciparum.

Translation of abstract (German)

Die globale Bedrohung für die menschliche Gesundheit durch Malaria bleibt weiterhin bestehen. Geschätzte 2.2 Millionen Menschen leben in endemischen Gebieten (Snow et al, 2005). Schnelle und effektive Behandlung sind entscheidend bei der Malariabekämpfung. Auf den Selektionsdruck durch Wirkstoffe reagiert der Parasit, Plasmodium falciparum, durch die Bildung von Resistenzen. In dieser Studie habe ich die Wechselwirkungen zwischen Wirkstoff und Parasit durch umsichtig geplante experimentelle Ansätze in vivo und in vitro untersucht. Zu Beginn wurden die Überlebenschancen des Parasiten in vivo, 7 Tage nach einer Behandlung analysiert. Anschließend wurden Isolate von Parasiten, die während der letzten Jahre unterschiedlichen Wirkstoffen in der Gemeinde von Pingilikani ausgesetzt waren, in vitro charakterisiert. Im letzten Teil der Arbeit habe ich versucht Einblicke in die Entstehung von Resistenzen in vitro zu erlangen. Resistenz wurde in vitro induziert um Resistenzmechanismen über einen Zeitraum von mehreren Monaten hin analysieren zu können. Besonders interessant war hier der Zusammenhang zwischen Vervielfältigung von Genen und das Auftreten von Punktmutationen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass durch eine hoch sensitive Methode 7 Tage nach Behandlungsbeginn (Artemisinin Kombinationspräparate oder Amodiaquin) in 64 von 156 Fällen (41%), noch Parasiten in a-symptomatischen Patienten nachgewiesen werden konnten. Die persistierende Parasitämie war jedoch nicht mit einem Risiko von wieder auftretenden Symptomen verbunden. Ein Zusammenhang mit der Parasitendichte zu Begin der Behandlung konnte jedoch in weniger immunen Patienten festgestellt werden. Die Analyse von Parasiten Isolaten wies auf eine starke Verbreitung von Anti-Folat Resistenz hin, hervorgerufen durch Mutationen in Pfdhfr. Gen Vervielfältigung wurde in den Genen des Folat Stoffwechsels nicht gefunden. Im Gegensatz dazu führten die Resistenz-Induktions-Experimente durch Pyrimethamin in vitro zu einer deutlichen Vervielfältigung von Pfdhfr in 3D7 (31-fach) und FCR3 (9-fach), die mit ausgeprägter Cross-Resistenz (Cycloguanil und Trimethoprim) verbunden war. Außerdem ist es mir gelungen, Vervielfältigung von Genen als mechanistische Grundlage für die Entstehung von Punktmutationen in P. falciparum zu beschreiben. Meine Daten zu persistierenden Parasiten nach Behandlung erlangen besondere Bedeutung, gerade im Hinblick auf kürzlich veröffentlichte Berichte über das Auftreten von Artemisin Resistenz im westlichen Kambodscha (Dondorp et al, 2009). Meine Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass einmal in einer Population etablierte resistente Phänotypen bestehen bleiben.