German Title: Charakterisierung von krankheitsverursachender Desminmutanten und ihre Assoziation mit alphaB-Crystallin in Desminopathie

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Abstract

Mutations in intermediate filaments (IFs) and associated proteins have been shown to cause a number of diseases in humans, ranging from blistering skin diseases to premature aging, as well as from cataract to cardiomyopathies. Desminopathy, a disease caused by dysfunctional mutations in type III muscle-specific IF protein desmin, constitutes a distinct sub-group of myofibrillar myopathies (MFM) manifesting as skeletal and / or cardiac myopathy. Mutations in the chaperone aB-crystallin, that supposedly maintains cytoskeletal integrity, have also been identified to cause MFM. Intracytoplasmic aggregates in desminopathy uniformly comprise aberrantly folded desmin that, among other proteins, recruits aB-crystallin. Currently, the molecular basis of sequential events that lead to such aggregates in the myocyte of patients harboring desmin mutations is not well understood. Thus, to unravel the molecular basis of desminopathy, we have investigated the interdependence between filament alterations arising from desmin mutations and their functional consequences in terms of interaction with the small heat shock protein aB-crystallin. We have systematically characterized various mutants spanning the non-a-helical aminoterminal “head”, central a-helical “rod” and non-a-helical carboxy-terminal “tail” domain of desmin. We show by in vitro characterization of the five head mutants, that two mutant variants residing in the conserved nonapeptide motif “SSYRRTFGG” of desmin - DesS13F and DesR16C - interfere with assembly by forming filamentous aggregates. Consistent with in vitro data, both mutants fail to generate a bona fide filament system in cells lacking a type III IF cytoskeleton. In cells expressing vimentin or desmin, both mutants fail to integrate into the endogenous filament network and severely affect its cellular localization. The novel desminopathy-causing mutant DesL377del22fs apparently interacts with wild-type desmin at dimer, tetramer and higher level of filament organization in vitro, but leads to a disruption of the IF cytoskeleton in cells. This mutant is not detectable in the myotubes of a heterozygous carrier even upon proteasome inhibition. Two – DesR454W and DesK449T - out of the six tail mutants form abnormal filaments during in vitro assembly and correspondingly generate aberrant filaments in cells devoid of type III IF protein cytoskeleton. The desmin fragment Des(ESA)delC244, resembling almost “first-half” of a desmin molecule, has deleterious effects on filament assembly in vitro as well as in transfected cells. It exhibits nucleoplasmic aggregates in two of the four investigated cell lines. With respect to characterizing the association of desmin disease mutants with aB-crystallin, data from yeast two-hybrid analyses, electron microscopy (EM), cosedimentation assay and viscometry distinctly suggest that the tail domain of desmin is pivotal in modulating its binding to aB-crystallin. We show that aB-crystallin binds to wild-type desmin filament under optimized buffer condition, but its binding to C-terminal deletion variants is either diminished or abolished. We speculate that this occurs due to differences in hydrophobic surface properties and exposed residues of wild-type desmin and its deletion variants. DesdelRDG is devoid of the conserved tripeptide motif “RDG”, yet it binds to aB-crystallin with similar strength as desmin wild-type. Thus, we propose that the prerequisite for binding of aB-crystallin to desmin is the 3-dimensional desmin protein conformation, which can be altered due to a mutation, and not the linear amino acid sequence involving conserved motifs per se. The two tail mutants – DesI451M and DesR454W - reveal weaker and stronger binding, respectively, to aB-crystallin as compared to wild-type protein. With respect to kinetics of binding, unlike desmin wild-type, DesR454W binds to aB-crystallin at all stages of assembly, and this probably results from its “open” filament structure both alone and in an equimolar mixture with wild-type desmin. Data from R454W and wild-type desmin transfection in 3T3 cells corroborate the in vitro data, showing that DesR454W binds around 50% more cytosolic aB-crystallin than desmin wild-type. Hence, our data suggest that mutations in desmin cause toxic gain-of-function, whereby the desmin mutants show enhanced binding to aB-crystallin. A plausible explanation for aggregate formation in desminopathy could be such modified protein-protein interactions. In summary, our data demonstrate the impact of desmin mutations not only on its structural property, but also on its molecular interaction with aB-crystallin. This adds to our understanding of the molecular basis of desminopathy as we show for the first time that subtle alterations in the nanoarchitecture of desmin filament are sufficient to induce aberrant interaction with an associated protein aB-crystallin. Such a modification might eventually contribute to the pathogenesis of desminopathy.

Translation of abstract (German)

Mutationen von Intermediärfilamenten und den mit ihnen assoziierten Proteinen können beim Menschen eine Reihe von Krankheiten verursachen, deren Spektrum von bullösen Hauterkrankungen über vorzeitiges Altern und Katarakt bis zu Kardionmyopathien reicht. Die Desminopathie, eine Krankheit, die durch dysfunktionale Mutationen im muskelspezifischen Typ- III-Intermediärfilamentprotein Desmin verursacht wird, ist die Ursache für eine spezifischen Untergruppe von myofibrillären Myopathien (MFM), die sich als skelettmuskuläre oder als kardiale Myopathien manifestieren. Mutationen in dem Chaperon B-Crystallin, das vermutlich zur zytoskelettalen Integrität beiträgt, wurden ebenfalls als Ursache für MFM erkannt. Intrazytoplasmatische Aggregate, die bei der Desminopathie auftreten, bestehen einheitlich aus irregulär gefaltetem Desmin, an das sich neben anderen Proteinen auch B-Crystallin anlagert. Zurzeit verstehen wir nicht die molekulare Grundlage der konsekutiven Ereignisse, die zur Bildung dieser Aggregate in den Myozyten von Patienten mit Desmin-Mutationen führen. Um die molekulare Grundlage der Desminopathie zu entschlüsseln, haben wir deshalb die gegenseitige Abhängigkeit von Filament-Veränderungen durch Desminmutationen und ihre funktionellen Folgen im Sinne der Interaktion mit dem kleinen Hitzeschockprotein B-Crystallin untersucht. Wir haben systematisch eine Reihe von Desminmutanten charakterisiert, die Veränderungen verteilt über die ganzen Länge des Desminmoleküls aufwiesen: von der nicht-α-helikalen, amino-terminalen Kopfdomäne über die zentrale, α-helikale und Stabdomäne bis hin zur nicht-α- helikalen, carboxy-terminalen Schwanzdomäne. Wir zeigten durch in vitro Charakterisierung der fünf Kopfmutanten, dass zwei Varianten (DesS13F und DesR16C), die in dem konservierten Nonapeptid-Motiv „SSYRRTFGG“ des Desmins liegen, den Filamentaufbau durch das Bilden von Aggregaten stören. Übereinstimmend mit den in vitro – Daten schaffen es beide Mutanten nicht, in Zellen ohne ein Typ-III IF-Zytoskelett ein echtes Filamentsystem zu erzeugen. In Zellen, die ein Desmin- oder Vimentinzytoskelett exprimieren, schafften es beide Mutanten nicht, sich in das Zytoskelett zu integrieren und beeinträchtigen seine zelluläre Lokalisation wesentlich. Der neue, Desminopathie-verursachende Mutant DesL37722fs interagiert mit Wildtyp-Desmin auf Dimer-, Tetramer- und höheren Ebenen der Filamentbildung in vitro, aber er zerreißt das IFZytoskelett in Zellen. Dieser Mutant ist in den Myotuben eines heterozygoten Trägers selbst beim Einsatz von Proteasominhibitoren nicht nachweisbar. Zwei von sechs Schwanzmutanten - DesR454W und DesK449T – bilden anormale Filamente bei in vitro – Filamentaufbau und erzeugen dementsprechend in Zellen, die kein Typ-III IF-Protein-Zytoskelett aufweisen, irreguläre Filamente. Das Desminfragment Des(ESA)C244, das an die “erste Hälfte” eines Desminmoleküls erinnert, hat zerstörerische Effekte auf den Filamentaufbau sowohl in vitro als auch in transfizierten Zellen, bei denen zwei der vier untersuchten Zelllinien Kern-Zytoplasma- Aggregate aufwiesen. Bezüglich der Beziehung zwischen Desminmutanten und B-Crystallin weisen Daten aus Hefe- Zwei-Hybrid-Analysen, Elektronenmikroskopie (EM), Kosedimentationsuntersuchung und Viskometrie deutlich darauf hin, dass die Schwanzdomäne des Desmins entscheidend für die Modulation seiner Bindung an B-Crystallin ist. Wir konnten demonstrieren, dass sich BCrystallin an Wildtyp-Desminfilamente unter optimierten Pufferbedingungen bindet, aber seine Bindung an C-terminale Deletionsvarianten ist entweder vermindert oder aufgehoben. Wir vermuten, dass das an den Unterschieden in den hydrophoben Oberflächeneigenschaften des Wildtyp-Desmins und seiner Deletionsvarianten liegt. Dem DesRDG fehlt das konservierte Tripeptid-Motiv „RDG“. Trotzdem bindet es an B-Crystallin mit einer ähnlichen Effizienz wie Wildtyp-Desmin. Deshalb folgern wir, dass die dreidimensionale Desminproteinkonformation, die durch Mutationen verändert werden kann, und nicht die lineare Aminosäurensequenz mit ihren konservierten Motiven an sich eine Voraussetzung für die Bindung von B-Crystallin an Desmin ist. Zwei Schwanzmutanten – DesI451M und DesR454W – zeigen im Vergleich zum Wildtyp- Protein schwächere bzw. stärkere Bindung an B-Crystallin. Bezüglich der Bindungskinetik bindet sich DesR454W, anderes als der Desmin Wildtyp, in allen Stadien des Filamentaufbaus an B-Crystallin, was vermutlich an seiner „offenen“ Filamentstruktur sowohl alleine als auch in equimolarer Mischung mit Wildtyp-Desmin liegt. Zelluläre Daten aus R454W- und Wildtyp- Desmin-Transfektionen von 3T3-Zellen bestätigen die in vitro – Daten, indem sie zeigen, dass DesR454W 50% mehr zytosolisches B-Crystallin bindet als der Desmin Wildtyp. Daher legen unsere Daten nahe, dass Desmin-Mutationen eine toxische Funktionsverstärkung verursachen, durch die die Desminmutanten eine verstärkte Bindung an B-Crystallin aufweisen. Diese modifizierten Protein-Protein-Interaktionen können eine plausible Erklärung für die Aggregatbildung in Desminopathien sein. Zusammengefasst zeigen unsere Daten die Auswirkung von Mutationen des Desmins sowohl auf seine strukturellen Eigenschaften als auch auf seine molekularen Interaktionen mit BCrystallin. Das trägt zu unserem Verständnis der molekularen Mechanismen der Desminopathien bei, da wir zeigen konnten, dass subtile Veränderungen in der Nanostruktur des Desminfilaments ausreichen, um abweichende Interaktionen mit dem assoziierten Protein B-Crystallin in der Zelle zu induzieren. Dies könnte zur Pathogenese der Desminopathie beitragen.