German Title: Transkriptomanalyse identifiziert Stammzellen und Immun-Gene in dem Cnidarier Hydractinia echinata

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Abstract

An increasing amount of Expressed Sequence Tag (EST) and genomic data predominantly for the cnidarians Acropora, Hydra and Nematostella, reveals that despite being one of the morphologically simplest multicellular animals, cnidarians possess a high genomic complexity. In order to contribute towards a broader coverage of this phylum, an EST project was performed to analyze the transcriptome of Hydractinia echinata. Moreover, transcriptional profiling experiments were carried out to characterize the i-cell population and the immune system of the hydroid. In this work a cDNA-library containing about 20,000 clones was constructed, which covers the entire life cycle of the organism and also represents some stress-induced conditions. After randomly sequencing almost 9,000 clones, EST characterization revealed a broad diversity of genes, with higher sequence similarity to vertebrates than to ecdysozoan invertebrates. Furthermore, a significant number of sequences hitherto unknown in metazoans were detected. The identification of unique Hydractinia sequences is consistent with the suggested high diversity and complexity of genes within the phylum. To store all the acquired information a database aimed at making the data widely available was created, which is accessible at www.mchips.org/hydractinia_echinata.html. To further characterize Hydractinia genes, a cDNA-microarray was constructed including the already sequenced ESTs as well as PCR-products from almost 5,000 un-sequenced cDNAs. Genes associated with the i-cell lineage were identified by the analysis of the gene expression profile of colonies depleted from their i-cells using mitomycin-C and colonies after the recovery from the treatment. Microarray normalized data ended up with 162 significant differentially expressed genes. Several growth and transcription factors as well as genes associated with undifferentiated cells were identified including; BMPs, Bzip/Mafl and CnPL10. In addition, i-cell depleted organisms exhibited an activation of genes involved in detoxification and wound healing activities. These genes are good candidates to define the i-cell population of Hydractinia. Genes associated with the immune system of Hydractinia were identified by the analysis of the expression profile of organisms having a LPS mimicked Gram-negative bacterial infection as well as an allogeneic reaction. 245 candidate genes with a significantly different expression level were identified. Genes associated with an LPS response encode for e.g. HSP70, lipocalin-like proteins, serine protease inhibitors, proteins with TSR domains and lectins. In the case of allorecognition, a probable whole genome response with up-and down regulation of hundreds of genes was observed; demonstrating a complex process. Some of the identified genes encode for e.g. minicollagens, transcriptional and growth factors, proteins with a protective function against oxygen metabolites or with potent inflammatory and neurotoxicity effects. Gene expression pattern analysis provided insights towards the function of many genes which are still unknown. In the case of genes with a known functional annotation, the microarray experiments either corroborated their characterization or defined an alternative one for Hydractinia. This project is the first high-throughput effort aimed to identify and characterize the transcriptome of the colonial marine hydroid Hydractinia echinata. The combination of the EST dataset, database and the microarray, provides a solid platform to promote and facilitate molecular research not only in Hydractinia but also in other cnidarians.

Translation of abstract (German)

Die zunehmende Menge an EST und genomischen Daten über Cnidarier, allen voran über Acropora, Hydra und Nematostella zeigt, dass Cnidarier trotz ihrer morphologischen Einfachheit eine große genomische Komplexität aufweisen. Um zu einem tieferen Verständnis des Phylums beizutragen, wurde ein EST Projekt realisiert, mit dessen Hilfe das Transkriptom des Hydroid Hydractinia echinata analysiert wurde. Zusätzlich wurden Experimente zur Analyse der Expressionsmuster durchgeführt, um die I-Zell Population und das angeborene Immunsystem des Hydroids zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine cDNA-Blibliothek mit insgesamt über 20.000 Genen erstellt, die den gesamten Lebenszyklus des Organismus abdeckt, und darüber hinaus einige stress-induzierte Konditionen repräsentiert. Die EST-Charakterisierung zeigt eine breite Vielfalt an Genen, wobei die Sequenzen eine größere Ähnlichkeit mit Vertebraten als mit Invertebraten der Ecdysozoen Gruppe aufweisen. Außerdem konnte eine signifikante Anzahl an Genen detektiert werden, die bisher in Metazoen unbekannt waren. Die Identifizierung der Hydractinia spezifischen Sequenzen unterstützt die Annahme einer großen Vielfalt und Komplexität der Gene innerhalb dieses Phylums. Zur Speicherung der gewonnen Informationen wurde eine allgemein zugängliche Datenbank angelegt, die unter www.mchips.org/hydractinia_echinata.html verfügbar ist. Um die Hydractinia Sequenzen näher zu untersuchen, wurde ein cDNA-Microarray erstellt, der die bereits sequenzierten ESTs sowie PCR-Produkte von fast 5.000 unsequenzierten cDNAs enthält. Die Identifizierung I-Zell assoziierter Gene erfolgte anhand der Genexpressionsprofile. Hierzu wurden die aufgrund der Mitomycin-C Behandlung I-Zell freien Kolonien mit Kolonien verglichen, die sich nach der Behandlung wieder regeneriert hatten. Aus den normalisierten Daten des Microarrays ergaben sich 162 signifikant unterschiedlich exprimierte Gene. Identifiziert wurden mehrere Wachstums- und Transkriptionsfaktoren, sowie Gene, die im Zusammenhang mit undifferenzierten Zellen stehen, einschließlich BMPs, Bzip/Mafl und CnPL10. Darüber hinaus zeigten I-Zell freie Organismen eine Aktivierung der in der Entgiftung und Wundheilung vorkommenden Gene. Diese Gene sind gute Kandidaten, um die I-Zell-Population von Hydractinia zu definieren. Zur Bestimmung der mit dem Immunsystem von Hydractinia assoziierten Gene, wurde eine Expressionsanalyse an Tieren durchgeführt, bei denen, mit LPS, eine bakterielle Infektion nachgeahmt wurde und die eine allogene Antwort zeigten. 245 Kandidatengene mit signifikant unterschiedlicher Expression konnten bestimmt werden. Gene, die mit einer LPS-Antwort in Verbindung stehen, kodieren für z. B. für HSP70, Lipocalin-ähnliche Proteine, Serin-Protease-Inhibitoren, Proteine mit TSR-Domänen und Lektinen. Im Falle der Allo-Erkennung wurde eine wahrscheinlich das ganze Genom umfassende Reaktion mit Hunderten von positiv und negativ regulierten Genen beobachtet, die einen komplexen Prozess vermuten lässt. Einige der identifizierten Gene kodieren bspw. für Minikollagene, Transkriptions-und Wachstumsfaktoren und für Proteine mit Schutzfunktion gegen Sauerstoff-Metaboliten oder mit stark entzündlichen und neurotoxischen Effekten. Die Analyse der Genexpressionsmuster lieferte Erkenntnisse über die Funktion vieler noch unbekannter Gene. Gene mit bereits bekannter Funktion, wurden durch die Microarray-Experimente entweder in ihre Annotation bestätigt, oder es konnte eine Alternativfunktion für Hydractinia definiert werden. Bei dieser Arbeit wurden erstmals Hochdurchsatztechnologien eingesetzt, um das Transkriptom der kolonialen marinen Hydroid, Hydractinia echinata zu identifizieren und charakterisieren. Die Kombination aus EST-Datensatz, Datenbank und Microarray, liefert eine zuverlässige Plattform um die molekulare Forschung an Hydractinia, aber auch an anderen Cnidariern zu fördern und zu vereinfachen.