Microcystins as Lead Structures for Anticancer Agents

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Zitierfähiger Link (URI): http://hdl.handle.net/10900/113384
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1133842
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-54760
Dokumentart: Dissertation
Erscheinungsdatum: 2022-11-05
Sprache: Englisch
Fakultät: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Fachbereich: Pharmazie
Gutachter: Niedermeyer, Timo H. J. (Prof. Dr.)
Tag der mündl. Prüfung: 2020-11-05
DDC-Klassifikation: 500 - Naturwissenschaften
540 - Chemie
570 - Biowissenschaften, Biologie
610 - Medizin, Gesundheit
Freie Schlagwörter: Microystin
Cyanobakterien
zytotoxisch
Vorläufer-dirigierte Biosynthese
Fluoreszenz-Mikroskopie
Lichtstreudetektor
OATP
Krebs
Bioorthogonale Chemie
anticancer
Precurser-directed biosynthesis
Fluorescence microscopy
Evaporative light scattering detector (ELSD)
OATP
Cancer
Microcystins
Click chemistry
Cyanobacteria
Bioorthogonal chemistry
cytotoxic
Lizenz: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

Krebserkrankungen entwickeln sich weltweit zum größten Problem für das Gesundheitswesen. Obwohl immer mehr Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen, die die Sterblichkeit nachweislich reduzieren, gibt es immer noch eine große Anzahl an Karzinomen, die nur schlecht darauf anspricht. Ein Großteil der Krebstherapeutika geht auf einen natürlichen Ursprung zurück. Eine Klasse zytotoxischer Naturstoffe bilden dabei die Microcystine, die zyklische Peptide aus Cyanobakterien sind. Allerdings kommen sie aufgrund ihrer schwerwiegenden Lebertoxizität nicht für einen direkten Einsatz am Patienten in Frage, weshalb neue Wege für eine klinische Anwendung verfolgt werden müssen. Das Ziel der vorgelegten Arbeit bestand darin, Microcystine mit bioorthogonalen („klickbaren“) chemischen Gruppen zu funktionalisieren, durch die es möglich würde sie als aktive Komponenten in Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten zu nutzen. Zunächst wurde eine vielseitig einsetzbare Methode entwickelt und optimiert um Microcystine in ausreichender Menge aus Cyanobakterien zu isolieren. Dabei kamen verschiedene Extraktions- und Trennungsverfahren, wie Flüssig-Flüssig-Extraktion, Flash- und Größenausschluss-Chromatographie und semipräparative HPLC zum Einsatz. Die einzelnen Schritte wurden zu einem effizienten Arbeitsablauf kombiniert, der auf drei unterschiedliche Mengen an Ausgangsmaterial ausgelegt ist. Ein integraler Bestandteil war außerdem die strukturunabhängige Quantifizierung von Microcystin-Derivaten mittels HPLC, die an einen evaporativen Lichtstreu-Detektor gekoppelt ist. Um die isolierten Microcystine strukturell und biologisch zu charakterisieren, wurden eine MS2-basierte Methode zur Strukturdereplikation und ein Zytotoxizitäts-Assay etabliert, der Rückschluss auf die Transporter-Selektivität der jeweiligen Derivate zulässt. Die Funktionalisierung der Microcystine mit klickbaren Gruppen gelang mittels Vorläufer-dirigierter Biosynthese. Indem Azido- und Alkyn-modifizierte Aminosäuren zur Kulturbrühe von Microcystin-produzierenden Stämmen gegeben wurden, wurden über 40 neue, klickbare Microcystine, einschließlich mehrerer, doppelt funktionalisierter Varianten, gebildet. Bei der Untersuchung der Einbaugeschwindigkeit eines Substrats stellte sich allerdings heraus, dass nur ein kleiner Prozentsatz der eingesetzten Aminosäure in Form von „klickbaren“ Microcystin wiedergefunden wurde. Um die verbliebene Menge an Substrat zurückzuverfolgen, wurde eine vergleichende DC-Methode mit einem fluorogenen Färbereagenz entwickelt. Dabei zeigte sich, dass auch andere Metabolite die bioorthogonale Funktion trugen. Dies ist ein wichtiger Aspekt, weil die klickbaren Microcystine auch für physiologische Studien in den Cyanobakterien genutzt werden sollten. Eines der „klickbaren“ Microcystine wurde isoliert und mit einem fluorogenen Farbstoff konjugiert. Sowohl das klickbare als auch das fluoreszenzmarkierte Microcystin wurden hinsichtlich ihrer Zytotoxizität charakterisiert. Die Aufnahme des fluoreszierenden Derivats in die Zellen wurde durch Fluoreszenz-Mikroskopie-Aufnahmen visualisiert. Die Datensätze aus beiden Versuchen zeigten, dass weder die bioorthogonale Gruppe noch der Fluoreszenz-Farbstoff einen Einfluss auf die pharmakologischen Eigenschaften der Microcystine haben. Diese Tatsache ist von entscheidender Bedeutung, wenn klickbare Microcystine zukünftig als Leitstrukturen für die Krebstherapie genutzt werden sollen.

Abstract:

Cancer is emerging as one of the main health issues worldwide. Although the development of conventional and, more recently, targeted therapies has contributed significantly to reduce cancer mortality, there is still a large number of malignancies with only poor responsiveness. Most clinically used anticancer drugs originate from natural sources. One such class of cytotoxic natural products are microcystins, cyanobacterial cyclic peptides. Because of their severe hepatotoxicity, however, they are inapt for a direct use as anticancer agents, and new ways were sought for their potential clinical application. The aim of the research presented here was to study whether bioorthogonal (clickable) functions can be introduced into microcystins, allowing for their use as warheads in antibody-drug-conjugates. In order to isolate microcystins in sufficient yields from the cyanobacterial biomass, an optimized and versatile protocol was compiled by combining different extraction modes and chromatographic techniques, such as liquid-liquid extraction, flash and size-exclusion chromatography, and semi-preparative HPLC. The workflow was optimized for three different amounts of starting material, covering a few miligrams to several grams. Furthermore, an HPLC method based on evaporative light-scattering detection was developed and validated, enabling a structure-independent quantification of microcystin variants. Lastly, the methodic toolbox was complemented with a MS2 method for structure dereplication and a cytotoxicity screening assay, which assesses the transport selectivity of the microcystin variants. Simultanously, an approach called precursor-directed biosynthesis was applied to generate clickable microcystins. Supplementing different azide or terminal alkyne-containing amino acid analogs into the cultivation medium of microcystin-producing cyanobacteria strains led to more than 40 new structures with bioorthogonal groups, including several dual-functionalized congeners. When studying the kinetics of substrate incorporation in more detail, it was observed that most of the alkyne-containing amino acid was not recovered as clickable microcystin. In order to trace back the lost amounts of substrate, a comparative TLC method was developed involving a bioorthognal, fluorogenic dye as TLC stain. This revealed that the bioorthogonal groups were also present in other metabolites, highlighting an important aspect if the clickable microcystins should also be used for physiological studies within the cyanobacteria. One clickable microcystin was isolated and labeled with a fluorogenic dye. Both the clickable microcystin and the resulting conjugate were characterized in terms of cytotoxicity. The transportability of the flurorescent microcystin was further demonstrated by fluorescence microscopy. The data showed that neither incorporation of the unnatural functional group nor attachment of the fluorescent label significantly affects the pharmacological properties of the microcystin, emphasizing the suitability of clickable microcystins as lead structures for anticancer agents.

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