Functional characterisation of the interplay between Ndc1, Nup53 and Nup155 in nuclear pore complex biogenesis

Abstract

In eukaryotic cells, the nucleus is enclosed by the two continuous membranes of the nuclear envelope establishing a physical barrier that spatially separates the nucleoplasm from the cytoplasm. To accommodate bidirectional transport across this barrier nuclear pore complexes (NPCs) form highly selective transport channels. These huge protein complexes coat the pore membrane region, which arises of the fusion of both nuclear envelope membranes. NPCs are constituted by the concerted assembly of hundreds of polypeptides from roughly 30 different proteins termed nucleoporins. Out of these, only three nucleoporins are stably integrated into the pore membrane to anchor the NPCs via transmembrane domains. Although accuracy of NPC assembly is essential to ensure cell viability and proliferation a detailed understanding of the complex NPC biogenesis is lacking. NPCs are assembled at two different phases of the metazoan cell cycle. At the end of every cell division NPCs have to re-assemble concomitantly with the re-forming nuclear envelope around the segregated daughter chromosomes. Additionally, NPCs are formed de novo during interphase into an intact nuclear envelope, which is also the exclusive assembly mode in organisms undergoing a closed mitosis as Saccharomyces cerevisiae. Particularly, how NPCs integrate both, in the growing nuclear envelope at the end of mitosis and the closed nuclear envelope during interphase, is by far and largely unknown. During my PhD work, I functionally characterised the transmembrane nucleoporin Ndc1, which is the only conserved integral membrane nucleoporin, in NPC assembly at the end of mitosis. Ndc1 is part of a crucial and conserved interaction network at the pore membrane where it interacts with Nup53 and Nup155, two nucleoporins belonging to the structural Nup93 complex. All three proteins are required for NPC assembly in yeast and metazoans but their specific roles as well as the role of their interactions were undetermined. By a detailed biochemical and cell biological analysis using purified recombinant proteins and in vitro nuclear assembly reactions, I reveal that the direct interaction of Ndc1 and Nup53 is essential for metazoan NPC formation at the end of mitosis. Ndc1 influences the membrane deformation activity of Nup53. This membrane deforming capability is specifically required for NPC assembly during interphase. As the Ndc1-Nup53 interaction and the membrane deformation function of Nup53 are also conserved in yeast this suggests that the interaction might be conserved functionally and also needed during interphasic NPC assembly. Nup53 is the central player of the Nup93 complex linking most complex members with each other and the pore membrane. However, it has been unresolved whether the interaction with Nup155 has an important role for NPC assembly. I demonstrate that the functional complex of Nup53 and Nup155 is required to recruit downstream nucleoporins via Nup93, another essential NPC protein, to nascent NPCs at the end of mitosis. Altogether, this study identifies the first elementary function of the conserved transmembrane nucleoporin Ndc1 and highlights new mechanistic details of the stepwise process of NPC assembly at the end of mitosis. Consequently, this new knowledge adds to a deeper understanding of the precise order and function of the early events during NPC biogenesis.

In Eukaryonten wird der Zellkern von einer Kernhülle, die aus zwei kontinuierlichen Membranen besteht, umschlossen. Diese Membranen bilden eine physikalische Barriere, welche das Zytoplasma vom Nukleoplasma räumlich trennt. Um Stofftransport in beide Richtungen über diese Barriere hinweg zu ermöglichen, formen Kernporenkomplexe äußerst selektive Transportkanäle. Diese riesigen Proteinkomplexe ummanteln den Bereich der Porenmembran, die durch die Verbindung der beiden Membranen entsteht. Kernporenkomplexe bestehen aus hunderten Polypeptiden von insgesamt etwa 30 verschiedenen Proteinen, sogenannten Nukleoporinen, die in einem diffizilen und fein aufeinander abgestimmten Prozess zusammengebaut werden. Von diesen Nukleoporinen sind nur drei fest in die Porenmembran integriert, welche die Kernporenkomplexe mittels Transmembrandomänen verankern. Obwohl der präzise Zusammenbau der Kernporen für das Überleben und die Proliferation von Zellen essentiell ist, fehlt bislang noch ein detailliertes Verständnis der komplexen Biogenese der Kernporenkomplexe. Bei Vielzellern entstehen Kernporenkomplexe in zwei unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus. Am Ende jeder Zellteilung müssen Kernporenkomplexe gleichzeitig mit der Kernhülle wieder aufgebaut werden, um die segregierten Tochter-Chromosomen zu umschließen. Darüber hinaus werden Kernporenkomplexe während der Interphase de novo in die intakte Kernhülle eingebaut. Diese Art des Kernporenbaus stellt auch den einzig möglichen Mechanismus bei Organismen wie Saccharomyces cerevisiae dar, die eine geschlossene Mitose vollziehen. Bislang ist es noch völlig unverstanden, wie Kernporenkomplexe sowohl in die wieder entstehende, wachsende Kernhülle am Ende der Mitose als auch in die geschlossene Kernhülle während der Interphase eingebaut werden. Im Rahmen meiner Doktorarbeit charakterisierte ich die Funktion des Transmembran-Nukleoporins Ndc1 beim Kernporenaufbau am Ende der Mitose, welches als einziges integrales Protein der Porenmembran konserviert ist. Ndc1 ist Teil eines wichtigen, konservierten Interaktionsnetzwerks an der Porenmembran, wo es mit den zwei Nukleoporinen Nup53 und Nup155, die zum strukturgebendenNup93-Komplex gehören, interagiert. Alle drei Proteine sind für den Kernporenbau sowohl in Hefe als auch in Mehrzellern zwingend erforderlich, aber ihre genaue Rolle sowie die Funktionen ihrer Interaktionen waren bislang unbekannt. Durch detaillierte zellbiologische und biochemische Untersuchungen mit aufgereinigten rekombinanten Proteinen und einem in vitro System, das den Kernporenaufbau nachstellt, zeige ich, dass die direkte Interaktion von Ndc1 und Nup53 bei Mehrzellern essentiell für den Kernporenaufbau am Ende der Mitose ist. Ndc1 moduliert die membran-verformende Aktivität von Nup53. Diese membran-verformende Aktivität ist für den Kernporenaufbau während der Interphase relevant und zwingend erforderlich. Die Tatsache, dass die Ndc1-Nup53-Interaktion und die membran-verformende Eigenschaft von Nup53 auch in Hefe konserviert sind, legt den Schluss nahe, dass die Interaktion auch funktionell konserviert und daher für den interphasischen Kernporenaufbau essentiell sein könnte. Nup53 ist der zentrale Baustein des Nup93-Komplexes, da er die meisten Proteine des Komplexes untereinander und mit der Porenmembran vernetzt. Trotzdem war es bislang unerforscht, ob seine Interaktion mit Nup155 eine bedeutende Rolle beim Kernporenaufbau spielt. Ich weise nach, dass ein funktioneller Komplex aus Nup53 und Nup155 am Ende der Mitose erforderlich ist, um im weiteren Prozess des Kernporenaufbaus benötigte Nukleoporine über Nup93, ein weiteres essentielles Nukleoporin für den Kernporenbau, an die intermediären Kernporenkomplexe zu rekrutieren. Insgesamt demonstriert diese Arbeit erstmals eine elementar wichtige Funktion des konservierten Transmembran-Nukleoporins Ndc1 und beleuchtet neue mechanistische Details des schrittweisen Aufbaus von Kernporenkomplexen am Ende der Mitose. Durch das neu gewonnene Wissen wird ein tieferes Verständnis des exakten mechanistischen Ablaufs und der Rolle einiger wichtiger, initialer Schritte der Biogenese von Kernporenkomplexen ermöglicht.