Biosensorsystem für vollständig automatisierte ultra-sensitive Multianalyt-Immunoassays

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Biosensorsystem für vollständig automatisierte ultra-sensitive Multianalyt-Immunoassays realisiert, charakterisiert und auf seine analytische Leistungsfähigkeit hin untersucht. Mit diesem Sensorsystem können ohne vorherige Aufkonzentrierung der Proben simultan mehrere verschiedene organische Schadstoffe in Oberflächengewässern, Grund- und Trinkwasser im unteren ng L-1 Bereich nachgewiesen werden. Das Sensorsystem AWACSS basiert dabei auf der Fluoreszenzanregung durch innere Totalreflektion (TIRF). Nach Design und Konstruktion erfolgte die Systemintegration der einzelnen optischen und fluidischen Komponenten. Dabei wurden verschiedene integriert-optische Transducer (IO-Chips) hinsichtlich ihrer optischen Eigenschaften und den dadurch bedingten Einfluss auf die Immunoassays charakterisiert. Für die statistische Bewertung von Kalibrierungen von Immunoassays kamen verschiedene Methoden für die Ermittlung der Validierungsparameter zum Einsatz. Die methodisch bedingten Unterschiede werden am Beispiel von Estronkalibrierungen mit einem polyklonalen Antikörper dargestellt und diskutiert.

Wesentlich für den erfolgreichen Einsatz dieses Biosensors als Überwachungssystem in der Gewässeranalytik war die Entwicklung einer mehrschichtigen ortsaufgelösten Oberflächenchemie. Bei dieser Multianalyt-Modifikation der IO-Chips wurden die Eigenschaften zweier Biopolymere kombiniert, die gleichzeitig zur kovalenten Ankopplung der Antigenmoleküle an die Oberfläche führt. Basierend auf dieser Oberflächenmodifikation konnte erstmalig eine simultane Multianalyt-Kalibrierung mit sechs polyklonalen Antikörpern im Testformat des Bindungshemmtests durchgeführt werden. Eine anschließende Validierung mit Realprobenmessungen, einem internationalen Ringversuch und einem Feldtest unter realistischen Einsatzbedingungen ergab, dass die analytische Leistungsfähigkeit dieses Biosensorsystems zu den klassischen Analyseverfahren (z. B. HPLC-DAD) vergleichbar ist. Dabei erfolgt eine Multianalyt-Messung innerhalb von 18 min ohne vorherige Aufkonzentrierung der Probe.

In this work, a biosensor-system for completely automated ultra-sensitive multianalyte-immunoassays was realized, characterized and examined for its analytical efficiency. This sensor system allows simultaneous measurements of several different organic pollutants in surface waters, ground- and drinking water in the lower ng L-1 range without requiring a pre-concentration step for the samples. The sensor system AWACSS is thereby based on excitation of fluorescence by total internal reflection (TIRF). After the design and construction phase, the system integration of the individual optical and fluid components took place. Different integrated-optical transducers (IO-chip) were characterized regarding their optical characteristics and their influence on the immunoassays. For the statistic evaluation of calibrations of immunoassays different methods were employed to determine the validation parameters. The method-specific differences were extracted and discussed, using as an example estrone-calibrations performed with a polyclonal antibody.

For the successful employment of this biosensor as a monitoring tool in water analytics, the development of a spatially resolved multi-layer surface chemistry was essential. During this multianalyte modification of the IO-chips, the characteristics of two bio-polymers were combined which resulted in the covalent coupling of the antigen-molecules to the surface. Based on this surface modification, a simultaneous multianalyte calibration with six polyclonal antibodies could be accomplished for the first time in the binding-inhibition test format. A subsequent validation by real-sample measurements, an international round-robin test and a field-test under realistic operating conditions showed that the analytical efficiency of this biosensor system is comparable to the classical analytical methods (e.g. HPLC-DAD). A multianalyte measurement takes 18 min without a pre-concentration step of the sample.