Expression und Charakterisierung volumenregulierter Osmolyt-Transportmoleküle des Gehirns

Abstract

Organische Osmolyte - wie Betain, Inositol und Taurin - spielen eine wichtige Rolle bei der zellulären Volumenregulation. Im Gegensatz zu den Aufnahmesystemen für organischen Osmolyte ist die molekulare Identität des Effluxweges noch völlig unklar. Postuliert wurde ein auswärtsgerichteter Anionenkanal genannt 'Volume-Sensitive Organic Osmolyte/Anion Channel' (VSOAC). Drei Kandidaten für den VSOAC - die Chloridkanäle CLC-2, CLC-3 und das ICln-Protein - wurden in vorliegender Arbeit im Xenopus laevis-Oocyten-Expressionsystem auf ihre Chlorid- bzw. Taurinpermeabilität hin untersucht. Die Untersuchung der Chloridpermeabilität cRNA-exprimierender Oocyten ergab, daß nur die Expression von CLC-2-cRNA zu einer schwellungsaktivierten Erhöhung des 36Cl--Transports und des Chloridstroms führte. Dagegen ergab die Untersuchung des Taurineffluxes, daß in den CLC-2-, CLC-3- und/oder ICln-cRNA-exprimierenden Oocyten eine signifikant höhere schwellungsinduzierte Taurinpermeabilität vorlag als in Kontrolloocyten. Durch weitere Experimente konnte ausgeschlossen werden, daß es sich hierbei um einen unspezifischen Leckflux handelte. Wahrscheinlich führt die Expression der getesteten Membranproteine zu einer Hochregulation eines endogenen Taurineffluxweges in Xenopus laevis-Oocyten. Die Unabhängigkeit des Taurineffluxes von einer Chloridpermeabilität spricht für die Existenz eines spezifischen endogenen Taurineffluxkanals in Xenopus laevis-Oocyten. Der Transporter zur Aufnahme des Osmolyten Betain - der Betain/GABA-Transporter BGT-1 - war bisher noch nicht gut untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde der BGT-1 mithilfe des Xenopus-laevis-Oocyten-Expressionssystems durch elektrophysiologische Messungen und radioaktive Fluxmessungen charakterisiert. Diese Untersuchungen zeigten, daß eine Kopplung des Transports von GABA mit dem von Na+ und Cl- in einer Stöchiometrie von 1:3:1 vorliegt. Aufgrund weiterer Ergebnisse wurde ein Modell für die Bindungsreihenfolge der Substrate entwickelt.

Organic osmolytes such as betaine, inositol and taurine play an important role in cell volume regulation. In contrast to the uptake systems of organic osmolytes the molecular identity of the efflux pathway is still elusive. An outwardly rectifying anion channel termed the 'Volume-Sensitive Organic Osmolyte/Anion Channel' (VSOAC), has been postulated. The chloride and taurine permeabilities of three candidates of the VSOAC, the chloride channels CLC-2, CLC-3 and the ICln protein, have been investigated in the present study using the Xenopus laevis oocytes expression system. The measurement of chloride permeabilities of cRNA-expressing oocytes showed that only the expression of CLC-2-cRNA resulted in a swelling-sensitive increase of 36Cl--transport and chloride current. In contrast, the measurement of taurine efflux revealed a significantly higher swelling-induced permeability of taurine in CLC-2-, CLC-3- and/or ICln-cRNA expressing oocytes as compared to control oocytes. Through further experiments, it was verified that these fluxes were not based on non-specific leakage. Most likely, the expression of the tested membrane proteins induces an endogenous taurine efflux pathway in Xenopus laevis oocytes. The independence of taurine efflux from any chloride permeability suggests the existence of an endogenous taurine efflux channel in Xenopus laevis oocytes. The transporter for the uptake of the osmolyte betaine, the Betaine/GABA-transporter BGT-1,had not been well characterized to date. In the present study, BGT-1 was characterized by electrophysiological and tracer flux measurements using the Xenopus laevis oocytes expression system. This study demonstrated that the transport of GABA is coupled to the transport of Na+ and Cl-, showing a coupling ratio of 1:3:1. Based on aditional results a model of the order of substrate binding was developed.