Structural Analysis of Human Growth Hormone with Respect to the Dominant Expression of GH Mutations in Isolated Growth Hormone Deficiency Type II

Abstract

Human GH protein consists of four alpha-helices and contains two disulfide bridges. Isolated growth hormone deficiency type II (IGHD II) is mainly caused by heterozygous splice site mutations of GH-1 leading to the disruption of one disulfide bridge (Cys53-Cys165) and to the loss of amino acids (aa) 32-71 which comprise the complete loop between alpha-helices 1 and 2. The mutant GH protein exerts a dominant-negative effect on wild-type (wt) GH secretion by unclear mechanisms. For the study of the structure-function relationship of GH mutants concerning the dominant-negative effect, expression vectors harbouring mutated GH cDNAs (the mutations affecting either the linker region between alpha-helices 1 and 2 or the disulfide bridge Cys182-Cys189) were transiently cotransfected with a vector encoding wtGH (pwtGH) into GH4C1 cells. Plasmids encoding either â-galactosidase, luciferase or IGFBP-2 were cotransfected with pwtGH and either of the GH mutants. For the study of a potential dominant-negative effect due to disturbed Zn2+-binding, expression vectors harbouring mutated GH cDNAs were constructed in which triplets encoding histidine and glutamine residues were mutated to triplets encoding alanine residues. These plasmids were transiently cotransfected with a vector encoding wtGH (pwtGH) into GH4C1 cells. Compared to the control transfection with pwtGH, GH secretion was mildly decreased by coexpressing wtGH and different GH point mutants with isolated disruption of the disulfide bridge Cys53-Cys165. Similar results were observed with GH mutants deleted in aa 32-46 or 32-52. Deletion of more aa (32-53, 32-63, 32-69, 32-71) ascendingly decreased GH secretion and content of GH in parallel with the increasing length of the deleted stretch. Disruption of the disulfide bridge constituted between Cys182-Cys189 in the fourth alpha-helix of GH protein (mutant del188-190GH) did not show to play a role in the exertion of the dominant-negative effect. Partial or complete disturbance of Zn2+-binding by amino-acid substitutions in the responsible domains also did not reveal to participate in the expression of the dominant-negative effect. An inhibitory dose-dependent effect of del32-69GH and del32-71GH on the activity/amount of coexpressed â-galactosidase, luciferase, and IGFBP-2 was found while mRNA levels were unaffected. Hence, the extent of deletion in the linker region between alpha-helices 1 and 2 played the major role in expression of the dominant-negative effect. The inhibitory effect of GH mutants on heterologously expressed non-GH proteins suggests that the dominant-negative effect is not limited to GH and not even to proteins of the regulated secretory pathway but may depend on expression levels.

Humanes Wachstumshormon (WH) besteht aus vier alpha-Helices und enthält zwei Disulfidbrücken. Der isolierte WH-Mangel Typ II wird hauptsächlich durch heterozygote Splice Site Mutationen des für WH codierenden GH-1 Gens verursacht. Diese Mutationen bewirken im mutierten WH eine Unterbrechung der Disulfidbrücke zwischen Cystein53 und Cystein165 und den Verlust des Aminosäurenstranges 32-71, der die Verbindungsschleife zwischen alpha-Helix 1 und 2 herstellt. Das mutierte WH übt einen dominant-negativen Effekt auf das natürliche WH aus, dessen Mechanismus unklar ist. Zur Untersuchung der Beziehung von strukturellen Veränderungen im WH zu ihren funktionellen Konsequenzen im Rahmen des o.g. dominant-negativen Effekts wurden Epressionsvektoren mit mutierter WHcDNA (Verkürzung der Verbindungsschleife 32-71 oder Aufhebung der Disulfidbrücke 53/165) zusammen mit einem Expressionsvektor für natürliches WH transient in Ratten-GH4C1-Tumorzellen transfiziert. Beta-Galactosidase, Luciferase oder IGFBP-2 wurden zusätzlich cotransfiziert. Zur Untersuchung der Bedeutung der Zink-Bindungsfähigkeit von WH im Rahmen des dominant-negativen Effekts von WH-Mutationen wurde GHcDNAs konstruiert, in denen Histidine und Glutamine in Alaninen mutiert waren. Cotransfektion erfolgte wie oben beschrieben. Im Vergleich zur Kontroll-Transfektion mit natürlichem WH, war die WH-Sekretion leicht vermindert, wenn natürliches WH mit mutiertem WH, das verschiedene Punktmutationen zur Unterbrechung der Disulfidbrücke 52/165 enthielt, coexprimiert wurde. Ähnliche Resultate ergaben Experimente mit den WH-Deletions-Mutanten 32-46 und 32-52. Hingegen bewirkten Deletionen eines längeren Aminosäurenstranges der Verbindungsschleife zwischen alpha-Helices 1 und 2 (32-53, 32-63, 32-69, 32-71) in Abhängigkeit von der Länge der Deletion eine zunehmende Verminderung der WH-Sekretion. Eine Unterbrechung der zweiten Disulfidbrücke des WH zwischen Cystein182 und Cystein189 blieb für die WH-Sekretion folgenlos. Ebenso zeigten die WH-Mutanten mit verminderten Zink-Affinität keinen dominant-negativen Effekt. Interessanterweise konnte dosis-abhängig auch ein hemmender Effekt von den WH-Mutanten del32-69 und del32-71 auf die Aktivität bzw. die Menge der coexprimierten beta-Galaktosidase, der Luciferase und des IGFBP-2 festgetellt werden, der sich auf mRNA-Ebene nicht darstellte.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Längenausdehnung der Deletion der Verbindungsschleife zwischen den alpha-Helices 1 und 2 hauptsächlich für den dominant-negativen Effekt der bei isoliertem WH-Mangel Typ 2 nachgewiesenen WH-Mutanten verantwortlich ist. Der gleichzeitig nachgewiesene inhibitorische Effekt auf die anderen heterlog exprimierten Proteine lässt vermuten, dass der dominant-negative Effekt nicht auf das natürliche WH und noch nicht einmal auf sekretorischen Proteine beschränkt bleibt, möglicherweise ist diese Wirkungen allerdings abhängig vom Expressionsgrad des Proteins.