Störungen des axonalen Transports bei der hereditären spastischen Spinalparalyse im Drosophila-Modell

Abstract

In dieser Arbeit wurden Störungen der Kinesin-Funktion als Ursache von SPG10, einer autosomal-dominanten Form der hereditären spastischen Spinalparalyse (HSP) im Drosophila-Modell untersucht. Ausgehend von den humanen Mutationen im KIF5A Gen, die zur HSP führen, wurde ein Drosophila-Modell entwickelt, um diesen Pathomechanismus zu untersuchen. Hierzu wurden Bewegungsanalysen, in vivo Messungen des axonalen Transports von Mitochondrien und Effekte der Mutationen auf die Synaptogenese untersucht. Mit Hilfe einer automatisierten Untersuchung des Laufverhaltens von Drosophilalarven zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen der Khc-Doppelmutanten Khc8/Khc13314 und den gesunden Tieren, die in Abhängigkeit von der Größe (dem Alter) der Tiere zunahmen. Auch bei den Larven mit einer für die HSP typischen Mutation (K253N) waren signifikante Unterschiede messbar, wenn die Mutation „full-length“ vorlag. Daraus folgt, dass für die Pathologie dieser Mutation die Bindung der Fracht notwendig ist. Bei den in vivo Messungen des axonalen Transports von Mitochondrien wurde sichtbar, dass in den Axonen Khc-mutanter Larven signifikant weniger Mitochondrien vorhanden sind als bei gesunden Kontrolltieren. Bei der folgenden Beobachtung der Mitochondrien im Zeitverlauf mittels FRAP (= Fluorescence Recovery after Photobleaching) zeigte sich eine Störung des langsamen und schnellen axonalen Transports, wobei sowohl der anterograde als auch der retrograde Transport beeinträchtigt war. Die Untersuchung des Effekts der Mutationen auf die Synaptogenese ergab kleinere NMJs bei der compound-heterozygoten Khc-Mutante, die absolut und anteilsmäßig weniger Mitochondrien enthalten. Die Synapsen der Einfachmutante enthielten im Gegensatz zu ihren Axonen nicht signifikant weniger Mitochondrien. Das erklärt sich wahrscheinlich mit einem noch ausreichenden Transport von Mitochondrien zur Synapse, wo diese dann verbleiben. Insgesamt zeigt die vorliegende Arbeit eine deutliche Beeinträchtigung des axonalen Transports und der Synapsenbildung als Folge der Mutation. Diese erklären auch die eingeschränkte Mobilität mutierter Larven. Damit imitiert das Drosophilamodell wesentliche Aspekte der humanen Erkrankung und legt nahe, dass dieser ähnliche Pathomechanismen zugrunde liegen.

This thesis presents a study of the pathomechanisms in kinesin function leading to SPG10, an autosomal dominant form of hereditary spastic paraplegia (HSP). Based on human mutations of KIF5A causing HSP a drosophila model was established. The effects of these mutations on the movement of larvae, axonal transport of mitochondria in vivo and synaptogenesis were studied. By means of an automated analysis of the movement of drosophila larvae, significant differences between the healthy animals and the ones with the double mutation Khc8/Khc13314 could be shown. These differences increased with the length (the age) of the larvae. The larvae expressing the mutation K253N, which leads to HSP in humans, also showed significant differences, but only when the mutation was expressed „full-length“. This led to the conclusion, that binding of cargo is a necessary part of the pathomechanism of this mutation. The in vivo studies of axonal transport of mitochondria made clear, that there are significantly less mitochondria in axons of khc-mutants, than in the ones of healthy larvae. The following analysis via FRAP (= Fluorescence Recovery after Photobleaching) showed an impairment of slow and fast axonal transport with impacts on anterograde and retrograde transport. The NMJs of compound-heterocygote khc-mutants were smaller and contained absolutely and proportionally less mitochondria than normal. The single mutation led to less mitochondria in axons, but not in synapses. This may be explained by a sufficient transport of mitochondria to the synapses, where they then stay. In total this work shows a clear impairment of axonal transport and synaptogenesis following the mutation, which also explains the impaired motility of the mutants. Therefore the drosophila model imitates major aspects of the human disease suggesting similar pathomechanisms.