Crystal structures of the major staphylococcal Autolysin E:How autolysins recognize and degrade the Gram-positive cell wall

Abstract

Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis are among the main causes of nosocomial infections. Treatment of hospital-acquired infections became a challenge since the number of staphylococcus strains with multiple antibiotic resistances increased steadily over the last decades. This emphasized the need for a new class of antibiotics that act on new targets. The major autolysins AtlE and AtlA of S. epidermidis and S. aureus, respectively, represent such targets. Both enzymes are crucial for cell viability. They take over key roles in cell division where they are responsible for the separation of daughter cells. The high-resolution structure of AmiE revealed for the first time detailed insights into the enzymatic function of a staphylococcal murein hydrolase and thereby provided the basis for the formulation of a likely mechanism of catalysis. PGN, the substrate of AmiE, is a large, polymeric macromolecule and as such not well suited for crystallization or affinity measurements. Although smaller fragments can be isolated from staphylococcal cell walls, their length and composition is highly dependent on the specific cleavage sites of the different murein hydrolases being used in this process. Furthermore, such purifications may not be completely monodispers. With the synthesis of PGN fluorescent substrates, however, a method was established that offered the possibility to produce substrates of defined length and high purity. Easy modifiability of the synthetic substrates also allowed probing the influence of amino acid substitutions on substrate recognition. In this thesis, a library of synthetic PGN substrates was constructed. The availability of a large range of substrates differing in length and composition of the peptide stem made it possible to define key motifs of PGN. It could be demonstrated that the presence of a third amino acid in the peptide stem as well as the isoform of glutamine in the second position are essential for recognition by AmiE. The carbohydrate moiety and the side chain of the third amino acid play only minor roles. These findings could be confirmed in a docking model. Structural comparisons with other proteins sharing the amidase-fold revealed common features in the substrate grooves, which points to an evolutionary conserved mechanism of PGN recognition. Contrary to previous assumptions according to which the CBR (cell wall binding region) of the AtlE amidase contained only two repeat domains, the crystal structure of R3,4 suggests the presence of four domains that belong to the family of SH3b domains. The sequence and structural similarity between every second repeat in the CBR is higher than between adjacent ones, which are connected via an extensive network of hydrogen bonds. A distinct patch of conserved residues could be located on opposite sides of each repeat in the R3,4 molecule. Both patches cover recessed areas with a strong electropositive potential, which might serve as binding pockets for negatively charged ligands such as teichoic acids. However, WTAs are not interaction partners of the repeat domains. It could be demonstrated that targeting of the AtlE amidase to the septum region is driven by an avoidance strategy towards WTAs, which are absent in this region. In the WTA-deficient S. aureus deltatagO mutant, binding of autolysins could be observed on the entire cell surface. The spatial distribution of LTAs on staphylococcal cell walls is not known so far. However, based on the position of the LTA synthase LtaS, Schirner et al. proposed a septum localization of LTAs for Bacillus subtilis, a finding that could also apply to Staphylococci. The putative septum localization, the charge complementarities between repeats and LTAs and the fact that binding of LTA was demonstrated for the InlB CBR, a structural homologue of the autolysin CBR, are pieces of evidence indicating that LTAs might serve as anchoring points for the major autolysins in the septum. Nevertheless, it has to be clarified if such an interaction would be specific and how autolysins are able to distinguish between molecules that are chemically and structurally as similar as WTAs and LTAs.

Staphylokokkus aureus und Staphylokokkus epidermidis gehören zu den Haupterregern nosokomialer Infektionen. Die Behandlung dieser Infektionen wurde in den letzten Jahrzehnten zu einer ernstzunehmenden Herausforderung, da die Zahl multiresistenter Staphylokokkenstämme stetig anstieg. Diese Tatsache betont die Notwendigkeit eine neue Klasse von Antibiotika zu entwickeln welche sich in ihrer Wirkungsweise von bisherigen Präparaten unterscheidet. Die Autolysine AtlE und AtlA von S. epidermidis und S. aureus übernehmen wichtige Rollen in der Zellteilung und stellen somit mögliche Ansatzpunkte für neue Antibiotika dar. Die hochauflösende Kristallstruktur von AmiE ermöglichte zum ersten Mal einen detaillierten Einblick in die enzymatische Funktion einer Staphylokokken-Mureinhydrolase. Basierend auf diesen Erkenntnissen konnte ein wahrscheinlicher Katalysemechanismus formuliert werden. Peptidoglykan (PGN), welches von AmiE als Substrat verwendet wird, ist ein polymeres Makromolekül welches sich aufgrund dieser Eigenschaften nicht für die Kristallisation oder Affinitätsmessungen eignet. Obwohl eine Isolierung kleinerer Fragmente aus der Zellwand von Staphylokokken möglich ist, ist die Länge und Zusammensetzung dieser Fragmente von den spezifischen Spaltstellen der Mureinhydrolasen abhängig, die hierfür verwendet werden. Darüber hinaus sind solche Reinigungen nicht vollständig monodispers. Die Synthese von PGN Fluoreszenzsubstraten ermöglichte es hingegen, Substrate definierter Länge und hoher Reinheit herzustellen. Die Modifizierbarkeit dieser Substrate erlaubte es außerdem den Einfluss von Substitutionen im Peptidanteil auf die Substraterkennung zu untersuchen. Im Verlauf dieser Arbeit wurde eine Vielzahl von Substraten synthetisiert welche sich in Länge und Zusammensetzung ihres Peptidanteils unterscheiden. Unter Verwendung dieser Substratderivate konnten schließlich PGN Motive definiert werden die eine Schlüsselposition einnehmen. Es konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit einer dritten Aminosäure im Peptid sowie ein Glutamin-Isomer in der zweiten Position essentiell für die Substraterkennung sind. Der Kohlenhydratanteil und die Seitenkette der dritten Aminosäure sind hingegen von geringerer Bedeutung. Diese Ergebnisse konnten in einem Docking-Modell bestätigt werden. Strukturelle Vergleiche mit anderen Proteinen welche eine ähnliche Tertiärstruktur aufweisen ließen außerdem gemeinsame Merkmale in der Substrattasche erkennen, was auf einen evolutionär konservierten Mechanismus der PGN Erkennung hindeutet. Entgegen früheren Annahmen, bezüglich welcher die Zellwandbinderegion (ZBR) der AtlE Amidase nur zwei Repeat Domänen umfasst, lässt die Kristallstruktur von R3,4 die Anwesenheit von vier Domänen vermuten, welche zur Familie der SH3b Domänen gehören. Die Aminosäuresequenzen jedes zweiten Repeats in der ZBR sind hierbei ähnlicher zueinander als die Sequenzen benachbarter Repeats, welche miteinander über ein ausgedehntes Wasserstoffbrückennetzwerk verbunden sind. Ein definierter Bereich konservierter Aminosäuren konnte auf einander gegenüberliegenden Seiten jedes Repeat im R3,4--Molekül identifiziert werden. Beide Bereiche liegen in Vertiefungen der Moleküloberfläche und weisen zudem ein hohes, elektropositives Potential auf. Es ist daher denkbar, dass diese Regionen als Bindungstaschen für stark negativ geladene Liganden wie z.B. Teichonsäuren dienen könnten. Es konnte allerdings gezeigt werden, dass Wandteichonsäuren (WTS) nicht als Interaktionspartner der Repeat-Domänen in Frage kommen. Die zielgerichtete Bindung der AtlE Amidase in der Septumregion ist das Resultat einer Vermeidungsstrategie gegenüber WTS, die in dieser Region fehlen. In der WTS-defizienten S. aureus deltatagO Mutante konnte die Bindung der AtlE Amidase hingegen auf der gesamten Zelloberfläche beobachtet werden. Über die räumliche Verteilung von Lipoteichonsäuren (LTS) auf Staphylokokkenzellwänden ist bisher nichts bekannt. Allerdings schlugen Schirner et al., basierend auf der Position der LTS-Synthase LtaS, eine Septumlokalisation von LTS für Bacillus subtilis vor. Eine entsprechende Lokalisierung ist auch in Staphylokokken vorstellbar wo LTS dazu dienen könnten Autolysine in der Teilungsebene zu positionieren. Die Ladungskomplementarität beider Moleküle sowie der Nachweis einer Interaktion zwischen LTS und der Zellwandbinderegion von InlB, welche homolog zur ZBR von AtlE ist, unterstützen diese Annahme. Es bleibt jedoch zu klären ob eine Interaktion zwischen Autolysinen und LTS spezifisch ist und wie es Autolysinen gelingt zwischen chemisch und strukturell ähnlichen Molekülen wie WTS und LTS zu differenzieren.