Dissection of the Role of FT and FD in the Regulation of Flowering in Arabidopsis thaliana

Abstract

The transition to flowering is under the control of various endogenous and environmental factors. These factors are perceived in different parts of the plant and trigger signaling cascades that are integrated at the shoot apex to eventually initiate the formation of flowers. Photoperiod is an important environmental regulator that controls flowering time. Daylength, which is perceived in the leaves, triggers a relay of signals that eventually lead to flowering. Genes like GIGANTEA and CONSTANS are required for determining daylength and in turn induce expression of FLOWERING LOCUS T (FT) in leaves. The FT protein then moves to the apex where it interacts with the bZIP transcription factor FD. In the current study, the FT protein was expressed by its native promoter, and tagged to three copies of Yellow Fluorescence Protein (YFP), to render it immobile. A Tobacco Etch Virus Protease cleavage site (TEVcs) was introduced between FT and the 3x YFP. When crossed to plants expressing TEV-Protease in the vasculature, the progeny were early flowering, due to the release of the small FT protein from the larger fusion complex by the protease. In another experiment, to confirm that the protein is in fact sufficient to induce flowering, a TEVcs was introduced into the FT protein. When crossed to plants expressing the TEV-Protease from the vasculature, the progeny were late flowering due to the cleavage of the florigenic signal, thereby rendering it non-functional. Since the interaction between FT and FD has only been shown by transcient assays or Yeast-2-hybridisation, I attempted to study the interaction between FT and FD at the shoot apex, where I generated a Bimolecular Fluorescence Complementation Assay by splitting the Yellow Fluorescence protein into two parts and tagging each part to FT and FD respectively. The FT-cYFP protein was expressed in the vasculature using the SUCROSE 2 (SUC2) promoter and FD-nYFP protein was expressed from its native promoter, which would result in reconstitution of the YFP at the apex due to the interaction between FT and FD, that could be studied by microscopy. To better understand the role of FD in the transcription factor network that controls the regulation of flowering at the shoot apex, I identified its targets on a genome-wide scale by microarray analyses. In a first step, constitutive overexpression of FD in leaves was used to identify potential downstream targets. Several MADS box genes were found to be upregulated in 35S::FD plants, including SEPALLATA3, SEPALLATA1, FRUITFUL, AGAMOUS and the known target, APETALA1. To discriminate between direct and indirect targets, FD was fused to ligand binding domain of the rat glucocorticoid receptor. Changes in gene expression in response to application of the glucocorticoid analog dexamethasone in the presence or absence of the translation inhibitor cycloheximide, were analyzed. While SEPALLATA3 and APETALA1 were recognized as direct targets of FD, AGAMOUS and SEPALLATA1 were clearly not. Electrophoretic mobility shift assays indicated that the FD protein was able to bind to the G-box on the SEPALLATA3 promoter. Temporal and spatial expression of the targets compared to that of the FD mRNA and protein showed that the protein had overlapping expression domains as its target RNAs, and there was a delay in the expression of the target genes in fd mutant plants compared to wild-type.

Der Übergang vom vegetativen Wachstum zur reproduktiven Entwicklung wird in Arabidopsis thaliana von definierten genetischen Signalwegen reguliert, die exogene Reize wie Tageslänge, die Qualität des Lichts, Temperatur, Überwinterung und endogenen Hinweise wie das Alter der Pflanze, den Hormonspiegel insbesondere Gibberellinsäure) usw. integrieren. Die Tageslänge (oder Photoperiode) wird in Pflanzen in den Blättern bestimmt. Unter den richtigen Bedingungen wird dabei in den Blättern ein, das Blühen induzierende, Langsteckensignal, genannt Florigen, gebildet und zum Sprossmeristem transportiert. Die Natur des Florigens wurde in der einschlägigen Literatur lang kontrovers diskutiert, aber neuere Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Produkt des FLOWERING LOCUS T (FT) Gens hierbei eine prominente Rolle spielt. Mehrere Experimente, die von verschiedenen Gruppen unabhängig voneinander durchgeführt wurden, haben, haben Hinweise darauf geliefert, dass das FT Protein in der Tat als Florigen fungiert. Da diese Ergebnisse aber samt und sonders auf Überexpression das FT Proteins beruhen blieben einige Fragen in Bezug auf die Funktion des nativen FT Proteins offen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das FT Protein auch dann als Florigen fungiert wenn es unter der Kontrolle der eigene regulatorischen Sequenzen exprimiert und auf eine Überexpression verzichtet wird. Hierzu wurde FT zum einem als Fusionsprotein mit drei Kopien des YFP fusioniert und somit ein Transport aus den Blättern zum Sprossapex verhindert. Erst nachdem FT mittels proteolytische Spaltung von diesem Fusionsprotein abgetrennt worden war, war es in der Lage das späte Blühen einer ft-­10 Mutante zu korrigieren. Unabhängig hiervon konnte eine Variante des FT Proteins erzeugt werden, die durch eine Protease gespalten und somit inaktiviert wurde. Mittels dieser Variante des FT Proteins gelang der Nachweis, dass das in den Blättern produzierte FT Protein notwendig ist, um das Blühen am Sprossapex zu induzieren. Da alle diese Experimente mit genomischen FT Konstrukten durchgsführt und auf ein Überexpression verzichtet wurde, kann man schlussfolgern, dass FT in der Tat als Florigen fungiert und sein Transport zum Sprossapex essentiell für die Induktion des Blühens ist. Am Sprossapex angekommen interagiert FT vermutlich mit dem bZIP Transkriptionsfaktor FD, der wiederum die Expression von homeotischen Genen, welche für die Bildung der Blüten verantwortlich sind, steuert. Bislang wurde die Interaktion zwischen FT und FD jedoch nur in Hefe-­Zwei-­Hybrid Untersuchungen und in transienten Assays in Pflanze bestätigt. Eine Bestätigung der Interaktion dieser beiden Proteine am Sprossapex steht noch aus. Um die Rolle von FD innerhalb des transkriptionellen Netzwerks, welches den Übergang zum Blühen am Sprossapex reguliert, besser zu verstehen, wurden in einem ersten Schritt in einer genomweiten Analyse Transkripte identifiziert, die in einer FD – Überexpressionslinie fehlreguliert sind. Dadurch konnten eine bekannte Schlüsselgene der Blühregulation und/oder der Blütenmusterbildung wie APETALA1, SEPALLATA 3, SEPALLATA1, FRUITFUL und AGAMOUS als möglich Zielgene von FD identifiziert werden. Da es sich bei diesen Genen wiederum um Transkriptionsfaktoren handelte, musste davon ausgegangen werden, dass zumindest einige dieser Gene nur indirekt durch FD reguliert werden. Um direkten indirekten Zielgene unterscheiden zu können wurden Transkriptomanalysen in GR-­ D Pflanzen, in denen FD mit der Ligandenbindedomäne des Glucocorticoidrezeptors (GR)fusioniert worden war, durchgeführt. Hierdurch konnten APETALA1 und SEPALLATA3 als direkte FD Zielgene verifiziert werden. Im Falle von SEPALLATE3 konnte darüber hinaus die Bindung von FD an eine G-Box im Promoter in vitro bestätigt werden. Ein interessantes Ergebnis dieser Arbeit war darüber hinaus, dass die Fähigkeit von FD die Expression seiner Zielgene zuaktivieren durch FT kooperativ verstärkt wurde. Um eine besser Vorstellung von der Rolle von FD am Sprossapex zu bekommen, wurde die zeitliche und räumliche Expression von FD und einiger seiner Zielgene analysiert. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass FT als Florigen fungiert und am Sprosspex zusammen mit FD eine Vielzahl von Zielgenen transkriptionell reguliert. Die Identifizierung direkter und indirekter FD Zielgene liefert darüber hinaus einen umfassenden Überblick über das FD-abhängige transkriptionelle Netzwerk, das die Induktion des Blühens am Sprossapex steuert.