Aspekte der peroxisomalen Dynamik: Frühe de novo Synthese und Bewegung von Peroxisomen durch Kinesine

Abstract

Peroxisomen sind sehr dynamische, ubiquitäre Zellorganellen, denen wichtige Funktionen beim Lipidstoffwechsel und beim Metabolismus oxidativer Spezies zukommen. Diese Organellen können zum einen durch Wachstum und Teilung vermehrt werden und zum anderen auch de novo gebildet werden. Bisher sind beim Menschen 14 Proteine bekannt, die so genannten Peroxine (PEX), die für die peroxisomale Biogenese essentiell sind. Fehlen PEX3, PEX16 oder PEX19, können in den Zellen keine peroxisomalen Membranstrukturen detektiert werden. Nach Transfektion der entsprechenden cDNA werden allerdings wieder voll funktionsfähige Peroxisomen ausgebildet. Vor allem die frühen Phasen der peroxisomalen Neubildung sind bisher wenig verstanden und die Herkunft der peroxisomalen Membran ist umstritten. Zusätzlich sind die Peroxine PEX3, PEX16 und PEX19 auch für den Import peroxisomaler Membranproteine (PMPs) verantwortlich.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die verschiedenen Phasen der peroxisomalen Neubildung durch Komplementation PEX16-defizienter humaner Fibroblasten (deltaPEX16) charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass zunächst PEX16- und PEX3-positive präperoxisomale Vesikel gebildet wurden, die in einem weiteren Schritt peroxisomale Membranproteine wie PEX14 importierten. Die Biogenese reifer Peroxisomen war nach 72 Stunden mit dem Import der Matrixproteine abgeschlossen. Dabei wurden weder Mikrotubuli und Aktinskelett noch die untersuchten Kinesine Kif5 (Kinesin-1) und KifC3 für die Entstehung dieser präperoxisomalen Vesikel benötigt. Die frühen PEX16-positiven Vesikel kolokalisierten nicht mit spezifischen Markern für „lipid rafts“ wie Caveolin-1 und Flotillin-1 und -2, so dass diese Membranstrukturen als Ursprung für die Vesikel weniger in Frage kamen. Vielmehr schienen die peroxisomalen Vorläufer an die einzelnen Lamellen des endoplasmatischen Reticulums (ER) angelagert zu sein, was hier durch Lebendzellbeobachtungen nach Expression von PEX16-YFP und eines ER-Markers in deltaPEX16 Zellen sichtbar gemacht wurde. Frühere Studien zeigten allerdings, dass die peroxisomale Biogenese in Säugerzellen unabhängig von COPI- oder COPII-Wegen abläuft.

„Knockdown“ von PEX19 und PEX16 mittels siRNA in humanen Fibroblasten zeigte einen PEX19-unabhängigen Importweg für PEX3 in die peroxisomale Membran und auch PEX16 wurde nur bei geringen Mengen an PEX3 für dessen Import benötigt. Daher ist ein posttranslationaler Import von PEX3 aus dem Cytosol in die peroxisomale Membran sehr wahrscheinlich.

Im Gegensatz zu anderen Organellen, wie dem endoplasmatischen Reticulum (ER) oder dem Golgi-Apparat, sind Peroxisomen gleichmäßig innerhalb der Zelle verteilt. Diese peroxisomale Lokalisation wird zum einen durch Bindung der Organellen an die Mikrotubuli und zum anderen durch den Transport von Peroxisomen entlang der Mikrotubuli mit Hilfe der Motorproteine Kinesin-1 (Kif5) und Dynein aufrecht erhalten. Mit Hilfe eines „yeast-two-hybdrid“ Versuches mit der AAA-ATPase PEX1 wurde zuvor ein weiteres Motorprotein, das C-terminale Kinesin KifC3, detektiert. Die Beteiligung von KifC3 beim peroxisomalen Transport entlang der Mikrotubuli konnte in dieser Arbeit gezeigt werden.

Lebendzellbeobachtungen ermöglichten die Verfolgung und Charakterisierung der gerichteten peroxisomalen Bewegung in vivo durch Expression von PEX16-YFP. „Knockdown“ von KifC3 mittels siRNA bewirkte nicht nur eine Zunahme der Zellen mit geclusterten Peroxisomen am Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC), sondern veränderte auch die Morphologie der Mitochondrien und des ERs. Die Ausprägung dieses peroxisomalen Phänotyps war unabhängig von der Zellphase, wohingegen intakte Mikrotubuli sich als essentiell für das perinukleäre Clustering der Peroxisomen heraus stellten. Die Interaktion von KifC3 mit PEX1 konnte sowohl in vivo als auch in vitro durch Coimmunopräzipitation nachgewiesen werden.

Es wurde eine regulatorische Rolle für KifC3 beim peroxisomalen Transport in Richtung des Mikrotubuli Minus-Endes postuliert, die sich durch Hemmung der Motorfunktion von Dynein an den Peroxisomen äußern könnte. „Knockdown“ von KifC3 würde somit zu einer Zunahme des peroxisomalen Transports in Richtung der Mikrotubuli-Minus Enden führen und ein Clustering der Peroxisomen am MTOC bewirken.

Peroxisomes are highly dynamic, ubiquitous cell organelles that play fundamental roles in the metabolism of lipids and oxidative species. These organelles multiply principally by growth and division but can also be synthesized de novo. Until now, 14 different proteins, the so called peroxins (PEX), are known to be essential for peroxisome biogenesis in humans. If PEX3, PEX16 or PEX19 are missing, the cells lack any detectable peroxisomal membrane structures. Fully functional peroxisomes are formed de novo upon transfection of the corresponding cDNA. The process of peroxisomal biogenesis especially the early steps is not well understood, and the origin of the peroxisomal membrane is currently under debate. The peroxins PEX3, PEX16 and PEX19 are also responsible for import of peroxisomal membrane proteins.

In this work the different steps of peroxisomal de novo synthesis were characterized by performing complementation studies of PEX16-deficient human fibroblasts. First PEX3- and PEX16-positive preperoxisomal vesicles were detected that imported peroxisomal membrane proteins like PEX14 in the next step. Biogenesis of mature peroxisomes was completed 72 hours after transfection by import of peroxisomal matrix proteins. Neither microtubules or the actin skeleton nor the analyzed kinesins Kif5 (Kinesin-1) or KifC3 were essential for formation of these preperoxisomal vesicles. As no colocalization of the early PEX16-positive vesicles with specific markers for „lipid rafts“ like Caveolin-1 and Flotillin-1 and -2 could be detected, these preperoxisomal structures are unlikely to originate from „lipid rafts“. These early vesicles rather seemed to be attached to the single lamellae of the endoplasmic reticulum (ER), which was visualized by live cell imaging after expression of PEX16-YFP and an ER-Marker in deltaPEX16 cells. However, earlier studies showed that the peroxisomal biogenesis was independent of COPI and COPII in mammalian cells.

Knockdown of PEX19 and PEX16 by siRNA in human fibroblasts revealed that PEX3 is imported into the peroxisomal membrane independently of PEX19, and PEX16 was only needed for import of PEX3 when small amounts of PEX3 were present. These data suggest a posttranslational import pathway for PEX3.

In contrast to other organelles like the ER or the golgi apparatus, peroxisomes are evenly distributed in the cell. This peroxisomal localisation is maintained first by binding of the organelles to microtubules and second by transport of peroxisomes along mictotubules with help of the motor proteins kinesin-1 (Kif5) and dynein. Another motor protein, the C-terminal Kinesin KifC3, was detected before in a yeast-two-hybrid assay with the AAA-ATPase PEX1.

The results of this work show that KifC3 is also involved in peroxisomal transport along microtubules. The directed long-range movements of peroxisomes were tracked and characterized in vivo by means of live cell imaging after expression of PEX16-YFP. Knockdown of KifC3 by siRNA not only increased the number of cells with clustered peroxisomes at the microtubule organizing center (MTOC), but also affected the morphology of mitochondria and the ER. The occurrence of this peroxisomal phenotype was independent of the cell phase, while intact microtubules were essential for perinuclear clustering of the peroxisomes. Interaction of KifC3 with PEX1 was verified in vivo and in vitro by coimmunoprecipitation.

Therefore it was postulated that KifC3 plays a regulatory role in peroxisomal transport towards the microtubule minus-ends for example by blocking the motor function of dynein at the peroxisomes. „Knockdown“ of KifC3 would then lead to increased minus end-directed peroxisomal transport and cause the observed peroxisomal clustering at the MTOC.