The role and therapeutic potential of key molecules in the developmental pathways of meningiomas

Abstract

Meningeome sind hauptsächlich benigne Gehirntumore, deren primäre Behandlung die mikrochirurgische Resektion ist. Trotz radikaler Exstirpation neigen auch benigne Meningeome zur Bildung von Rezidiven (10-30%), deren weitere Behandlung auf Grund eines Mangels an chemotherapeutischen Therapien deutlich eingeschränkt ist. Bei der Entwicklung einer chemotherapeutischen Behandlung von benignen Tumoren müssen neben der Wirksamkeit des Medikaments auch mögliche Nebenwirkungen mit in Betracht gezogen werden, da diese den Patienten nicht unverhältnismäßig belasten sollten. Um verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse bei der Verwendung von Meningeomprimärzellkulturen zu erhalten, war die Etablierung neuer sensitiver Methoden unerlässlich. Dazu gehörte die Auswahl eines optimalen Referenzgens für quantitative Real-Time PCR sowie die Optimierung der neuen Methode Taqman® Protein Assay für verschiedene Proteine unter anderem für aktive Caspase-3 als Apoptosenachweis. Für einen sicheren Apoptosenachweis ist es sinnvoll, zwei unterschiedliche Methoden zu verwenden, die zudem an verschiedenen Punkten im Ablauf der Apoptose messen. Als eindeutigen apoptotischen Nachweis wurden folgende Methoden angewandt: die immunhistochemische Färbung von einzelsträngiger DNA (ssDNA), Western Blot-Nachweis von geschnittener PARP1 und die Quantifizierung von aktiver Caspase-3 mit Hilfe von Taqman® Protein Assay. Während das Auftreten aktiver Caspase-3 und geschnittener PARP1 Kriterien früher Apoptose darstellen, kennzeichnet die Fragmentierung von DNA das Spätstadium der Apoptose. Der immunhistochemische Nachweis von ssDNA wurde dem wesentlich häufiger verwendeten TUNEL-Test vorgezogen, da der TUNEL-Test kein spezifischer Apoptosenachweis ist. Taqman® Protein Assay ist eine erst kürzlich entwickelte hochsensitive Methode zur Proteinquantifizierung, welche Antikörper mit Hilfe des „Proximity Ligation Assays“ mit der quantitativen Real-Time PCR verbindet. Die immunzytologische Färbung von ssDNA wies die Induktion von Apoptose in Meningeomen nach einer 24-stündigen Behandlung mit 2 µM Farnesol nach. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die mit dem Taqman® Protein Assay quantifizierte Expression von aktiver Caspase-3 mit der mit Hilfe eines Western Blots nachgewiesenen geschnittenen PARP1-Expression korrelierte. Dabei wies der Taqman® Protein Assay eine signifikant höhere Sensitivität auf als ein klassischer Western Blot. Zudem konnte gezeigt werden, dass Farnesol in sehr niedrigen Dosen unterschiedlich auf Meningeome wirkt. Während in Gruppe 1 die Expression von aktiver Caspase-3 erst nach 2-stündiger Gabe von 2 µM Farnesol abrupt anstieg, erhöhte sich in Gruppe 2 der aktive Caspase-3 Level mit steigender Farnesol-Konzentration. Damit konnte mit Hilfe des Taqman® Protein Assay für aktive Caspase-3 demonstriert werden, dass aktive Caspase-3 bereits in sehr geringen Konzentrationen in Meningeomen zuverlässig detektiert und quantifiziert werden kann. Mit Hilfe der quantitativen Real-Time PCR und dem Taqman® Protein Assay war es möglich zu zeigen, dass Meningeome den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptor 2 (VEGFR2) nur wenig bzw. nicht exprimieren. Zudem weisen Meningeome eine erhöhte thrombozytärer Wachstumsfaktorrezeptor beta (PDGFRbeta)- und eine reduzierte PDGFB-Expression auf. Meningeomprimärzellkulturen, die mit exogenem VEGF stimuliert wurden, wiesen eine deutlich erhöhte Proliferation auf. Wurde PDGFRbeta vor der Gabe von exogenem VEGFA gehemmt, hob sich dieser proliferierende Stimulus auf. Außerdem konnte belegt werden, dass VEGFA vergleichbar wie PDGFB konzentrations-abhängig die Tyrosin-Phosphorylierung von PDGFRbeta induziert. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Wirkung verschiedener Tyrosinrezeptor-Inhibitoren verglichen. Sunitinib, ein bereits zugelassenes Chemotherapeutikum, welches vorzugsweise KDR aber auch PDGFRbeta hemmt, beeinträchtigte die Migration von Meningeomen in gleicher Weise wie Tandutinib, das eine hohe Aktivität gegenüber PDGFRbeta aufweist aber eine sehr geringe Aktivität gegenüber KDR. Zudem konnte gezeigt werden, dass Gambogic Acid ebenso die Zellmigration von Meningeomen beeinträchtigt und dabei die VEGFA-induzierte PDGFRbeta-Tyrosinphosphorylierung unterdrückt. Damit ist es gelungen zu beweisen, dass erstens VEGFA in Meningeomen die Zellmigration hauptsächlich durch PDGFRbeta und nicht durch KDR reguliert und dass zweitens Gambogic Acid ein potenter Inhibitor des Meningeomwachstums in vitro ist.

Meningiomas are mostly benign brain tumors. The primary treatment is microsurgical resection. Meningiomas are prone to develop recurrences (10-30%) despite radical extirpation, whose further treatment is significantly restricted due to the lack of chemotherapeutical therapies. In the development of a chemotherapeutical treatment of benign tumors not only the efficacy of a drug has to be taken into consideration but also possible side effects, so the patient is not disproportionately strained. To obtain reliable and reproducible results using primary meningioma cell cultures it was essential to establish more sensitive methods. This included die selection of an optimal reference gene for quantitative Real-Time PCR as well as the optimization of the new method Taqman Protein Assay for various proteins for example active caspase-3 for apoptosis detection. For reliable apoptosis detection two different methods should be used, which in addition measure at different points in the apoptotic process. For the distinct detection of apoptosis the following methods were used: immunohistochemical staining of single-stranded DNA (ssDNA), determination of cleaved PARP1 using western blot, and the quantification of active caspase-3 using Taqman® Protein Assay. Whereas the appearance of active caspase-3 and cleaved PARP1 are a hallmark of early apoptosis, fragmentation of DNA characterizes late-stage apoptosis. The immunohistochemical detection of ssDNA was chosen over the commonly used TUNEL test, because TUNEL is not specific for apoptosis. Taqman® Protein Assay is a recently developed highly sensitive method for protein quantification, which utilizes antibodies and proximity ligation for quantitative Real-Time PCR. The immunohistochemical staining of ssDNA showed the induction of apoptosis in meningiomas after treatment with 2 µM farnesol for 24 hours. Expression of active caspase-3, which was quantified using the Taqman® Protein Assay, correlated with cleaved PARP1 expression, which was determined using western blot. Thereby the Taqman® Protein Assay exhibited a significantly higher sensitivity than the western blot. In addition, low concentrations of farnesol affected meningiomas differently. In group 1 the expression of active caspase-3 increased abruptly after treatment with 2 µM farnesol for 2 hours, whereas the level of active caspase-3 rose with increasing farnesol concentration. Summarizing the study showed, that Taqman® Protein Assay for active caspase-3 is able to reliably detect and quantify active caspase-3 in very low concentrations in meningiomas. Using quantitative Real-Time PCR and Taqman® Protein Assay it was possible to demonstrate, that meningiomas express little to none vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) in vitro and in vivo. In addition, meningiomas display an increased platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFRbeta) expression level and show a reduced PDGFB expression. Primary meningioma cell cultures, which were stimulated with exogenous VEGFA, exhibited a significant higher proliferation rate. If PDGFRbeta was inhibited before administration of exogenous VEGFA, this proliferative stimulus was abolished. Furthermore VEGFA induced concentration-dependent PDGFRbeta tyrosine phosphorylation comparable to PDGFB-induced PDGFRbeta tyrosine phosphorylation. Based on these results several tyrosine receptor inhibitors were tested. Sunitinib, an already approved chemotherapeutic agent, which inhibits preverentially KDR, but also inhibits PDGFRbeta, equally impaired migration of meningioma cells as tandutinib, which displays a high activity towards PDGFRbeta but a low activity towards KDR. Moreover gambogic acid equally impaired cell migration of meningiomas and also suppressed VEGFA-induced PDGFRbeta tyrosine phosphorylation. In the first place the study established that VEGFA regulates cell migration mostly through PDGFRbeta not KDR in meningiomas. Secondly it was able to show, that gambogic acid is a potent inhibitor of meningioma cell growth in vitro.