Charakterisierung leukämischer Progenitorzellen im NOD/SCID-Mausmodell mittels Hoechst 33342

Abstract

Zusammenfassung der Dissertation von Reinhard Hörrmann

Titel: Charakterisierung leukämischer Progenitorzellen im NOD/SCID-Mausmodell mittels Hoechst 33342

Man geht davon aus, dass Leukämien auf genetisch veränderte HSC oder auf Zellen, welche Eigenschaften von HSC wiedererlangen, zurückzuführen sind. In vielen Fällen ist nur eine kleine Population von leukämischen Stammzellen zur Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung fähig. Das heißt, nur diese Zellen sind fähig, alle Zellen einer Leukämie zu generieren und spielen somit eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und Erhaltung einer Leukämie. Diese unreifen leukämischen Progenitorzellen haben bestimmte Eigenschaften, wie dem Verharren in einem Art Ruhezustand (G0-Phase des Zellzyklus) und dem Besitz von membranständigen Transporterproteinen (Effluxpumpen), mit welchen sie toxische Substanzen aktiv aus der Zelle transportieren können und dadurch besonders widerstandsfähig gegen Chemotherapeutika sind. Somit scheinen die leukämischen Progenitorzellen einen entscheidenden Beitrag bei der Initiierung eines Rezidivs zu spielen. Daher ist es von besonderem Interesse und Bestandteil dieser Arbeit, die leukämischen Progenitorzellen nachzuweisen und dadurch mögliche Targets zu finden, über die man die leukämischen Progenitorzellen mittels Medikamente gezielt zerstören kann. Zur Charakterisierung von leukämischen Progenitorzellen werden bis heute vor allem die Oberflächenantigene CD34/CD38 benutzt, doch ist dieses Vorgehen zum Nachweis von leukämischen Progenitorzellen in vielen Fällen unzuverlässig bzw. unzureichend untersucht. Der Grund dafür ist unter anderem, dass leukämische Zellen Oberflächenantigene aberrant und variabel exprimieren. Ziel der aktuellen Forschung ist es, weitere Marker zu finden, welche die Population der leukämischen Progenitorzellen besser identifiziert und weiter eingrenzt. In dieser Arbeit wurde der Farbstoff Hoechst 33342 zum Nachweis der leukämischen Progenitorzellen benutzt. Dieses Molekül reichert sich intrazellulär an und bindet im Zellkern an DNA. Zellen mit Stammzelleigenschaften haben die Möglichkeit, diesen Farbstoff über spezielle Transporterproteine an der Zellmembran aus der Zelle zu transportieren. Diese Zellen können durchflusszytometrisch erfasst werden und bilden eine distinkte Population, die side population (SP), welche mit frühen Stammzellen stark angereichert ist. Um die leukämischen Zellen und insbesondere die leukämischen Progenitorzellen genauer charakterisieren zu können und dadurch mögliche spezifische Targets zu finden, die als Angriffspunkte von Medikamenten verwendet werden können, ist ausreichend Probenmaterial erforderlich. In der vorliegenden Arbeit vermehrten wir darum leukämische Zellen von an Leukämie erkrankten Kindern im NOD/LtSz-scid IL2Rγnull (NSG) Mausmodell. Im Anschluss analysierten wir die humanen leukämischen Zellen aus der Maus durchflusszytometrisch. Wir untersuchten Einflussfaktoren der Leukämiearten (B-ALL, T-ALL und AML) und des Mausmodells. Zudem verglichen wir die SP-Population mit der CD34+/CD38--Zellpopulation. In unseren Ergebnissen konnten wir zeigen, dass der Anteil der SP an den leukämischen Zellen nicht von der Leukämieart abhängt. Zudem bestätigten wir die Vermutung aus Vorarbeiten, dass es sich bei der SP und der CD34+/CD38--Zellpopulation um verschiedene Stammzellpopulationen handelt. Die Untersuchungen der Einflussfaktoren des Mausmodells ergaben, dass diese die humanen leukämischen Zellen nicht signifikant beeinflussten: Weder die Transplantationshäufigkeit noch die murine Hämatopoese haben einen nachweisbaren Einfluss auf die leukämischen Zellen und insbesondere auf die leukämischen Progenitorzellen. Zudem konnten wir zeigen, dass der Anteil der SP von den humanen leukämischen Zellen aus der Maus mit den an Primärmaterial gemessenen SP-Werten vergleichbar ist. Somit steht mit dem NOD/LtSz-scid IL2R Gamma null (NSG) Mausmodell eine Möglichkeit zur Verfügung, um leukämische Zellen und insbesondere die unreifen LSC-artigen Zellen zu vervielfältigen und im Anschluss daran weitere Untersuchungen durchzuführen, deren Ergebnisse mit den an Primärmaterial gewonnenen Ergebnissen vergleichbar sind.

Summary of the dissertation by Reinhard Hörrmann

Title: Characterization of leukemic progenitor cells in the NOD/SCID mouse model using Hoechst 33342

It is thought that leukemia lead back to genetically modified HSC or cells regain the properties of HSC. In many cases only a small population of leukemic stem cells is capable to self-renewal, proliferation and differentiation. This means that only these cells are able to generate all the cells of leukemia and thus play a crucial role in the development and maintenance of leukemia. These immature leukemic progenitor cells have certain characteristics, such as persistence in a kind of resting state (G0 phase of the cell cycle) and the possession of membrane transporter proteins (efflux pumps), by which toxic substances can be carried out of the cell actively. That’s why these cells are especially resistant to chemotherapeutic agents. The leukemic progenitor cells seem to play a key role in the initiation of a recurrence. Therefore, it is of partiular interest and part of this work to prove the leukemic progenitor cells. After that it’s necessary to identify possible targets by which the leukemic progenitor cells can be destroyed using specific drugs. For the characterization of leukemic progenitor cells are still used the surface antigens CD34/CD38. But this procedure for the detection of leukemic progenitor cells is in many cases unreliable or insufficiently investigated. One reason is that leukemic cells express aberrantly and variably the surface antigens. The aim of the current research is to find additional markers which identify the population of leukemic progenitor cells more specifically. In this work, the dye Hoechst 33342 was used for the detection of leukemic progenitor cells. This molecule accumulates intracellularly and binds in the nucleus to DNA. Cells with stem cell properties have the ability to transport this dye out of the cell with specific transporter proteins which are located in the cell membrane. These cells can be detected by flow cytometry and form a distinct population, the side population (SP), which is highly enriched with early stem cells. To characterize the leukemic cells and in particular the leukemic progenitor cells more precisely, sufficient sample material is required. In the present study we therefore increased leukemic cells of children diagnosed with leukemia in the NOD/SCID-LtSz IL2R Gamma null (NSG) mouse model. Subsequently, we analyzed the human leukemic cells from the mice by flow cytometry. We examined influencing factors of the leukemias (B-ALL, T-ALL and AML) and of the mouse model. In addition, we compared SP population with the CD34+/CD38- cell population. In our results, we could show that the proportion of the SP of the leukemic cells does not depend on the type of leukemia. We also confirmed the assumption of preliminary studies that the SP and the CD34+/CD38- cell population are different stem cell populations. The investigations of the influencing factors of the mouse model showed that these factors did not influence the human leukemic cells significantly: neither the transplantation frequency nor the murine hematopoietic have a detectable effect on the leukemic cells and in particular on the leukemic progenitor cells. We also showed that the proportion of the SP (from the human leukemic cells of the mice) is comparable with the measured SP values from the primary material. With the NOD / LtSz-scid IL2Rγnull (NSG) mouse model we have a possibility to amplify leukemic cells and especially the immature LSC-like cells. These can be used for further investigations whose results are comparable with the findings of primary material results.