Studies on the biosynthesis and heterologous expression of tubulysin

Abstract

The tubulysins are a family of nine complex peptides with promising cytotoxic activity against multi drug-resistant tumors. This thesis reports a third tubulysin producing strain, Cystobacter sp. SBCb004. Although the tubulysin biosynthetic gene clusters appear to be incomplete in both SBCb004 and An d48, comparison of the clusters reveals a conserved 11-gene architecture, which allowed the assignment of cluster boundaries. Knockout mutagenesis and in vitro assay of genes located at both ends of the conserved cluster revealed their involvement and possible functions in the tubulysin pathway. Pretubulysin was identified from both natural producer strains, confirming its intermediacy in the pathway. Using a combination of feeding studies and high-resolution tandem mass spectrometry, An d48 and SBCb004 were found to biosynthesize 32 additional tubulysin derivatives. Using Red/ET recombineering, the entire tubulysin core gene cluster from strain SBCb004 was reconstituted and successfully expressed in heterologous host strains Pseudomonas putida and Myxococcus xanthus. Finally, BLAST analysis of the SBCb004 genome data was carried out to identify candidate monooxygenases, whose involvements in tubulysin assembly were evaluated using a combination of knockout mutagenesis and heterologous expression.

Tubulysine stellen eine Familie von neun komplexe Peptiden dar, welche viel versprechende zytotoxische Eigenschaften gegen multiresistente Tumore aufweisen. In dieser Arbeit wird ein dritter Stamm beschrieben, welcher Tubulysine produziert (Cystobacter sp. SBCb004). Obwohl die Tubulysin-Biosynthesegencluster aus SBCb004 und An d48 unvollständig erscheinen, zeigt ein Vergleich der Gencluster eine konservierte Architektur von elf Genen auf, wodurch die Grenzen des Clusters definiert werden konnten. Über Geninaktivierungsstudien und in vitro Assays konnte die Beteiligung und mögliche Funktion von Genen, welche an beiden Enden der Gencluster in konservierter Form gefunden wurden, aufgezeigt werden. Prätubulysin wurde in den Extrakten beider natürlichen Produzentenstämme identifiziert und so als Biosyntheseintermediat bestätigt. Zudem wurde basierend auf der Kombination von hochauflösender Massenspektrometrie und Fütterungsexperimenten nachgewiesen, dass An d48 und SBCb004 zusammen 32 zusätzliche Tubulysinderivate herstellen. Der Tubulysin-Biosynthesegencluster aus Stamm SBCb004 ausgehend mittels Red/ET Recombineering rekonstituiert und dann heterolog in Pseudomonas putida und Myxococcus xanthus exprimiert. BLAST Analysen des Genoms von SBCb004 zeigten die Präsenz von multiplen Monooxygenasen auf, deren Beteiligung an der Tubulysinbiosynthese durch eine Kombination von Inaktivierungsmutagenese und heterologer Expression studiert wurde.