Laseroptische Methoden zur Untersuchung von intra- und extrazellulären Eisbildungsprozessen im Hinblick auf Schädigungsmechanismen bei der Kryokonservierung therapeutisch relevanter Zellen

Abstract

Nahezu sämtliche experimentellen Verfahren der Zellbiologie sind auf die flüssige Umgebung ihrer Proben angewiesen und im gefrorenen Probenzustand nicht anwendbar. Im Vergleich zur Biologie verfügt die Kryobiologie daher über ein eingeschränktes Instrumentarium. Im Rahmen dieser Arbeit sollen speziell zur Klärung der chemischen Randbedingungen sowie der mikroskopischen Prozesse während des Einfrierens Multiphotonenmikroskopie und konfokale Ramanmikrokopie in die Kryobiologie eingeführt werden. Diese Techniken ermöglichen es erstmals, die Probe während des Kryokonservierungsprozess mikroskopisch zu beobachten. Auf Basis von ramanmikroskopischen Daten zur Zusammensetzung der zellulären Umgebung und des Zellinneren wurden an Stammzellen des Nabelschnurbluts vereinfachte Modellvorstellungen zu osmotischen Prozessen während des Einfrierens überprüft. Weiterhin wurden die experimentellen Daten zur systematischen Optimierung von Biobankingprotokollen genutzt. Erstmalig konnte durch die Ramanmikroskopie gezeigt werden, dass bei der DMSO-basierten Kryokonservierung von Zellen das Zytoplasma amorph erstarrt. Ausgehend von der spektroskopischen Unterscheidbarkeit kristallinen und amorphen Wassers wurde eine Technik zur Kontrolle von vitrifizierten Proben auf Devitrifikation – der vollständigen Kristallisation und somit Zerstörung der Probe – bei tiefkalten Lagerbedingungen am verschlossenen Gebinde entworfen und demonstriert.

Almost all experimental methods for cell biology research are dependent on the fluid environment of their samples and therefore, they are not applicable in the frozen state of the samples. Compared to biology, cryobiology has a limited amount of research instruments. In this study the multiphoton microscopy and the confocal Raman microscopy shall be introduced into cryobiology, especially to clarify the chemical boundary conditions and the microscopic processes during the freezing step. These techniques allow for the first time, to observe the sample by a microscope during the cryopreservation process. Based on Raman microscopic data, the composition of the cellular environment and the cell interior were investigated and a simplified model regarding osmotic processes while freezing stem cells of umbilical cord blood was reviewed. Furthermore, the experimental data were used for the systematic optimization of protocols for biobanking. It could be shown for the first time by the Raman microscopy that in the DMSO-based cryopreservation cytoplasm solidifies amorphously. Based on the spectroscopic distinguishability of crystalline and amorphous water, a technique for the control of vitrified samples based on devitrification - the complete crystallization and thus destruction of the sample – was designed and demonstrated at cryogenic storage conditions in on the sealed container.