In der vorliegenden Arbeit wurden Transportproteine der Solute Carrier Family in verschiedenen Fischspezies identifiziert. Diese Transporter wurden charakterisiert in Bezug auf deren Organ spezifische Expression und außerdem deren Substratspezifität, wobei der Fokus auf dem Transport des Cyanotoxins Microcystin (MC) lag.
MC ist eines der vielen Toxine das von Cyanobakterien (auch Blaualgen genannt) gebildet wird. Diese kommen weltweit hauptsächlich im Süßwasser vor, konnten aber auch in marinen Gewässern gefunden werden. Unter günstigen Bedingungen findet ein Massenauftreten (sogenannte Algenblüten) statt und damit einhergehend eine hohe Produktion an Toxinen, die nach Zersetzung der Zellen in das Wasser abgegeben werden. Aus diesem Grund stellen Cyanobakterien eine Gefahr für Organismen verschiedener Entwicklungsstufen, trophischer Ebenen und Habitate dar. Da Fische einer toxischen Cyanobakterienblüte nur bedingt ausweichen können, sind sie besonders exponiert. Tatsächlich wurde MC in zahlreichen Feld- und Laborexperimenten in verschiedenen Fischspezies nachgewiesen. Nach akuter MC- Exposition wurden pathologischen Organveränderungen bis hin zu Massensterben von Fischen beobachtet. Interessanterweise weisen dabei verschiedene Fischarten eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber MC auf, deren Ursache bisher ungeklärt ist. MC ist das weltweit am häufigsten vorkommende Cyanotoxin. Es handelt sich um ein ca. 1000 Da schweres Heptapeptid. Bisher sind mehr als 100 Kongenere dieses Toxins bekannt, welche sich hauptsächlich in einzelnen Aminosäuren voneinander unterscheiden, aber auch in ihrer Toxizität differieren Microcystine erzeugen aufgrund des first-pass-effects eine hohe Zytotoxizität in der Leber, weisen jedoch auch eine markante Nieren- und Neurotoxizität auf. Die Zytotoxizität wird durch die kovalente Bindung von MC an Serin- und Threonin Protein Phosphatasen und somit deren funktionellen Inhibition vermittelt. Die daraus resultierende Veränderung des Phosphorylierungsgleichgewichts der Zelle führt zu Zerfall des Zytoskeletts, veränderter Signaltransduktion, oxidativem Stress und schließlich Zelltod durch Apoptose und Nekrose. Um Phosphatasen inhibieren zu können, muss MC zunächst allerdings zunächst in die Zelle gelangen. Aufgrund der Struktur, Größe und chemischen Eigenschaften von MC ist eine Aufnahme mittels Membrantransportern notwendig. Im Menschen und in Nagern konnte gezeigt werden, dass dieser Transport durch das Zellmembranprotein Organic Anion transporting polypeptides (Oatp) vermittelt wird. Auch im Rochen (Rajas erinacea), einem Knorpelfisch, konnte der Transport des MC-Kongeners MC-LR durch Oatp nachgewiesen werden.
Es gibt diverse Subtypen von Oatps in mehr als 40 Spezies, welche auf Grund der Ähnlichkeit ihrer Aminosäuresequenz in Familien und Subfamilien eingeteilt werden können. Generell transportieren Oatps ein weites Spektrum an endo- und xenobiotischen Substraten und können in allen Organen vorkommen, jedoch gibt es subtypenspezifische Unterschiede.
Die Aufnahme eines Toxins in die Zelle stellt eine kritische Schlüsselstelle in der Kinetik und die dadurch vermittelte Dynamik und der finalen Zytotoxizität dar. Durch Identifizierung neuer Oatp-Subtypen in verschiedenen Fischarten und deren Expressionsmuster in verschiedenen Fischorganen kann somit abgeschätzt werden, welche Organe von einer MC Intoxikation betroffen sein könnten und welche Fischarten sensibler gegenüber MC sind.
Ziel dieser Arbeit war daher
• Die Klonierung neuer Oatps aus verschiedenen einheimischen Fischarten, welche im Bodensee vorkommen sowie die Charakterisierung dieser Oatps bezüglich organspezifischer Expression und Funktionalität.
• Die Identifizierung von Oatps in einheimischen und Modell-Fischen, welche zu einem MC Transport beitragen können.
• Die Rolle von verschiedenen Oatps in Zebrafischen bei der Kongener abhängigen Toxikokinetik.
Dazu wurde zunächst eine Oatp Sequenz mittels einer cDNA-Bibliothek aus der Leber der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) kloniert, welche als Oatp1d1 klassifiziert wurde. Es handelt sich hierbei um einen Subtyp, der bisher nur in Fischen gefunden wurde. Der Transport von bekannten Oatp Substraten wurde daraufhin mit radioaktiv markierten Substanzen untersucht, von ausgewählten Substanzen wurde zusätzlich eine Kinetik erstellt. Um zu überprüfen ob es sich um einen MC-Transporter handelt wurden Oatp transfizierte HEK293-Zellen MC ausgesetzt und die Aufnahme des Toxins indirekt mittels Immunoblot nachgewiesen. Die funktionelle Charakterisierung zeigte, dass es sich um einen multispezifischen Transporter handelt, der ähnlich wie die im Menschen vorhandenen Transporter OATP1B3 und OATP1B1 diverse Substrate inklusive MC transportiert und primär in der Leber vorkommt. Im Gegensatz zu OATP1B3 und OATP1B1 konnte Oatp1d1 jedoch auch im Gehirn der Fische gefunden werden, was eine Neurotoxizität von MC begründen könnte.
Der Vergleich des Expressionsmuster von Oatps zweier im Bodensee lebenden Fischarten sollte Aufschluss über die Sensitivität gegenüber MC in verschiedenen Spezies geben. Dafür wurde der fischspezifische Oatp1d1, welcher sowohl im Rochen als auch in der Regenbogenforelle MC transportiert, aus der Leber des Bodenseefelchens (Coregonus wartmanni, Salmonidae) und des Karpfens (Cyprinius carpio, Cyprinidae) kloniert. Hierbei wurde für das Karpfen Oatp eine cDNA-Bibliothek erstellt, die Oatp1d1 Sequenz aus dem Felchen wurde mittels RACE-PCR isoliert. Mittels semi-quantitativer real time PCR konnte gezeigt werden, dass Oatp1d1 im Felchen hauptsächlich in der Leber exprimiert wird, jedoch kann auch im Gehirn Oatp1d1 RNA nachgewiesen werden. Eine fast identische Organverteilung von Oatp1d1 konnte zuvor in der nah verwandten Regenbogenforelle gefunden werden. Im Vergleich dazu zeigt sich im Karpfen eine zusätzliche Expression in der Niere, welche quantitativ zwischen Gehirn und Leber liegt. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass Oatp1d1 ein MC Transporter in verschiedenen Fischspezies in der Leber und höchstwahrscheinlich auch im Gehirn ist. Zusätzlich könnte er zu einem Transport in die Niere im Karpfen beitragen.
Dennoch kann durch die Expression von Oatp1d1 noch nicht die hauptsächlich in Karpfen und Regenbogenforelle beobachtete Aufnahme von MC in andere Organe erklärt werden. Es liegt nahe, das weitere Transporter vorhanden sein müssen, welche für die Aufnahme von MC verantwortlich sind. Da für den Modellorganismus Zebrafisch (Danio rerio) alle Oatp Subtypen publiziert und annotiert sind, wurde deren Sequenz genutzt um weitere Transporter bezügliche ihrer MC Aufnahme zu untersuchen. Dabei wurden verschiedene Kongenere angeschaut um die beobachteten Unterschiede in der vermittelten Toxizität erklären zu können. Es konnte gezeigt werden, dass neben Oatp1d1 auch die nierenspezifischen Transporter Oatp1f2 und Oatp1f4 MC transportieren. Während Oatp1d1 alle getesteten MC-Kongenere (MC-LR, MC-LW, MC-LF und MC-RR) transportiert, transportiert Oatp1f2 nur MC-LR, MC-LW und MC-LF. Beide Transporter zeigten jedoch eine höhere Aufnahmegeschwindigkeit für MC-LW und MC-LF im Vergleich zu MC-LR, was deren höhere bzw. schneller vermittelte Toxizität begründet.
Obwohl Oatp1f2 und Oatp1f4 in ihrer Aminosäuresequenz zu ca. 87 % identisch sind, transportiert Oatp1f4 nur MC-LF. Dies deutet darauf hin, dass Unterschiede in einzelnen Aminosäuren zur Substratspezifität beitragen können.
Zusammenfassend konnten durch diese Dissertation neue Oatp-Sequenzen in Fischen gefunden werden, die für den MC-Transport in verschiedene Organe verantwortlich sind und daher eine Schlüsselrolle in der Kinetik von MC darstellen. Es konnte gezeigt werden, dass diverse MC-Kongenere transportiert werden und die Expression der Oatps von der jeweiligen Fischspezies abhängt, was eine individuelle Speziessensitivität erklären könnte. Diese Ergebnisse unterstützen daher die Aufklärung der Toxikokinetik von MC in Fischen, die zur Risikoabschätzung sowohl für die Auswirkungen auf das Ökosystem als auch auf die menschliche Gesundheit essentiell sind.