Synthesis and mass spectrometric structural chracterization of ubiquitin conjugates

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Dissertation
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Zusammenfassung

Ubiquitin (Ub) is a small-conserved protein consisting of 76 amino acids, and plays an important role in different intracellular processes through covalently conjugation with another proteins mediated by the enzymes E1, E2 and E3. Ubiquitin is found in all eukaryotic cells as a monomer or as a isopeptide-linked polymers called polyubiquitin chains and those are attached to the substrate or to itself by a covalently interaction between the ε-amino group of an internal lysine residue in the bound ubiquitin and a glycine residue in the C-terminal of the consecutive ubiquitin moiety. Ubiquitin contains seven lysine residues (Lys6, 11, 27, 29, 33, 48 and 63) and each of these lysines can be modified for different polyubiquitin chain formation. Importantly, it appears that the specific lysine residue of ubiquitin used for ubiquitin-ubiquitin chain formation determines the biochemical and biological function, thus requiring a detailed chemical structure-function evaluation of the respective ubiquitin conjugates. For example, Lys48-linked polyubiquitin chains serve as a signal targeting the modified proteins for degradation by the 26S proteasome, while Lys63-linked polyubiquitin chains have been linked to non-proteolytic processes. So, an attractive possibility is that the different functions of different polyubiquitin chains are mediated by proteins that selectively interact with the respective chain. However, the present knowledge about the structures, biochemical activities, and biological functions of polyubiquitin chains differentiated by branching sites and isomeric structures is rather limited. So, this is to a major study due to the fact that appropriate tools including the preparation of defined polyubiquitin chains, the structural chracterization of these conjugates, and antibodies that are specific for defined polyubiquitin chains ("linkage-specific antibodies") are hitherto missing or not known and are difficult to develop.


In the first study of this thesis, a series of chemically defined polyubiquitin chains that differ by the lysine residue used for Ub-Ub conjugation was synthesized by chemical and biochemical means and characterized by high performance mass spectrometry. Advanced methods of semi-automated solid phase peptide synthesis and chemoselective ligation have been developed and successfully applied to the preparation and molecular characterization of linear ubiquitin and polyubiquitin chains. According to chemoselective ligation-based approach, the ubiquitin conjugation reaction was performed in solution, under slightly alkaline conditions, between the N-chloroacetylated ubiquitin and the ubiquitin containing one cysteine residue with a free thiol group in the sequence by thioether linkage formation. The recombinant "donor" ubiquitin in which the C-terminal amino group is replaced by a cysteine, was prepared by bacteria cell expression and the synthetic "acceptor" ubiquitin in which the N-terminal amino group is chloroacetylated was manually synthesized on TGA resin according to the Fmoc chemistry. This approach was successfully applied for the preparation of linear (mono-)ubiquitin conjugates, which will be used for moiety of branched Lys63-NH2ε-linked di-ubiquitin conjugate. In-situ simultaneous halide exchange was employed for the conversion of the N-chloroacetylated to N-iodoacetylated ubiquitin acceptor peptide for increasing reactivity in order to conjugate with recombinant His-tagged ubiquitin-Cys donor component. As an example, a linear- (mono-)ubiquitin conjugatates; ClAc-Ub (54-76) with His-tagged Ub(G53C) 11, and ClAc-Ub (61-76) with His-tagged Ub(N60C) 12, were successfully prepared, and the structure of the 10.70 kDa and 10.63 kDa ubiquitin adducts ascertained by ESI ion trap mass spectrometry. To assess the biochemical activity of the synthetic ubiquitin conjugates containing a cysteine residue; the linear (mono-)ubiquitin conjugates 11, 12 were analyzed in vitro in auto-ubiquitination assays with two different enzymes (E6-AP and HectH9). The synthetic linear ubiquitin conjugation system with efficiency similar to wild-type ubiquitin, indicates the feasibility of the mutated linear ubiquitins by thioether ligation approaches in producing biochemically active conjugates.


Based on the performance of linear (mono-)ubiquitin conjugates by chemoselective ligation, the synthesis of oligo-ubiquitin conjugates with defined Lys-ε-amino branching sites was designed and developed. The preparation of specific isomeric Lys-branched conjugates also utilizes a chemoselective ligation approach with chemically stable thioether linkages using (i), an activated N-chloroacylated partial ubiquitin acceptor peptide containing the specific lysine linkage residue, prepared by manual synthesis, and (ii), thioether ligation to a ubiquitin donor peptide that contains a C-terminal Cys residue at the defined conjugation site. According to the strategy, K63-linked di-ubiquitin conjugate 13, was successfully prepared and characterized by HPLC, circular dichroism spectroscopy and ESI ion trap MS which was determined the average molecular weight (21383.97 Da) are consistent with the correct element formula C932H1508N282O287S4 by. The synthetic approach of specific Lys linked ubiquitin conjugates should be feasible as a general route for the preparation of oligo-ubiquitin conjugates that can be used (i), to evaluate the biochemical properties of isomeric poly-ubiquitin conjugates, and (ii), for the preparation of antibodies that selectively recognize different ubiquitin chains depending on the specific lysine residue of ubiquitin used for chain formation.


With the advent of recombinant DNA technology and the availability of numerous expression systems, preparation of Lys63- or Lys48- linked di-/tetra- ubiquitin chain components by recombinant Escherichia coli cell expression combination with enzymatic synthesis in vitro were efficiently available. The method involves a series of enzymatic reactions in which proximally and distally blocked monoubiquitins (or chains) are conjugated to produce a particular chain in high yield. Individual chains are then deblocked and joined in another round of reaction. To perform successful bioanalytical applications on molecular structure chracterization of different lysine linked ubiquitin conjugates, efficient and sensitive analytical methods such as a mass spectrometer with MALDI-TOF, Nano-ESI, Ion Trap, CD spectroscopy and molecular modelling were have been required. After separated by 15 % Tris-Tricine SDS-PAGE, the specific lysine linkage ubiquitin modifications were subjected by treatment of passive elution. The purified Lys48- or Lys63-linked di-/tera- ubiquitin chains were characterized by FTICR high resolution mass spectrometry, showing multiple charge distributions with experimental molecular masses of
K63 Di-Ub - mexp = 17157,25 Da, mcalc = 17157,39 Da

K63 Tetra-Ub - mexp = 34330,38 Da, mcalc = 34326,40 Da

K48 Di-Ub - mexp = 17201,18 Da, mcalc = 17201,29 Da
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A comparative application of high resolution mass spectrometry together with CD spectroscopy has been successfully applied for the conformational differentiation of defined Lys48- and Lys63-linked di-ubiquitin conjugates, conformation-specific methods are required for structural bases distinguishing of different specific lysine linked di-ubiquitin conjugates. Ion mobility mass spectrometry (IM–MS) has been recently emerging as a highly effective tool for the separation and identification of structural transitions of ubiquitin ions in the gas phase. Investigating gas-phase structures of protein ions can lead to an improved understanding of intramolecular forces that play an important role in protein folding. Hence, the separative capacity of IMS is highly complementary to MS analysis. The structural comparison of Lys48- and Lys63-linked di-ubiquitin conjugates showed that, Lys63 linked chain is considerably more elongated than Lys48 linked chain. Collisional cross-section distributions appear identical for compact structures that exist for the +13 to +17 charge states of both conjugates, while elongated conformers showed distinct differences for the specific lysine-ε-amino linkages. Elongated conformers exist for both types of conjugates in the cross-section distributions of charge states +14 to +19, with collisional cross-sections for these ions ranging from ~3100 Å2 for [K48 di-ubiquitin +14H]14+ to ~3700 Å2 for [K63 di-ubiquitin +19H]19+. For the elongated charge states of conformers, cross-sections of K63 linked di-ubiquitin are on average 3.5 % larger than those of K48 linked di-ubiquitin, indicating that K48 linked conjugates adopt a more compact structure than K63 linked conjugates. The ion mobility-MS results were in full agreement with a comparative molecular modeling study of the Lys63- and Lys48- linked conjugates, suggesting a more compact Lys48 linked conformation to be required for targeting conjugated substrate proteins for proteolytic, proteasome degradation. These results of the gas phase structures are consistent with previous NMR spectroscopy data in solution phase. Characterizing the structures of proteins in the absence of solvent is suggested to be useful for (і), the comparison of gas-phase results with structural information from solution provides insight about how solvent interactions influence structure; (іі), the characterization of gas phase ion structures may become an important factor in the development of new analytical techniques for studying mixtures of proteins conformers.

In the last part of the thesis, the binding of synthesized specific Lys linked ubiquitin conjugates to the monoclonal specific K63 linkage ubiquitin antibody (clone HWA4C4) was studied by affinity-mass spectrometry, immunoblotting methods such as dot blot and western blot. These immuno-analytical techniques were a powerful tool for characterising recognition specificities of different lysine linked ubiquitin conjugates. Affinity-MS data proved the binding of the synthetic ubiquitin peptides containing in their sequences a lysine63 residue to the K63 linkage ubiquitin antibody. The results of the dot blot test confirmed the specifically binding of the K63-Ub antibody to the partial ubiquitin peptides containing Lys6 or Lys63 attached to a Gly-Gly dipeptide. In contrast, for partial ubiquitin sequences contained the Lys11, Lys33 and Lys48 were no response observed. And also Western blot observed that the K63 linkage ubiquitin antibody gave an intense positive response only for the recombinant K63-linked di-/tetra- ubiquitin conjugates but no response for control ubiquitin and K48-linked di-ubiquitin. The comparison of the three methods provided consistent results to reveal differences in binding affinities and specificities by the K63 linkage ubiquitin antibody, showing that antibody binding is influenced by ubiquitin peptides containing in their sequences a lys63 residue and its secondary structure. For mass spectrometric epitope identification, an affinity column was prepared using the purified K63-Ub antibody. The epitope elucidation of Ub(57-69)_K63-GG peptide was accomplished by excision and extraction experiments. The results indicate that the fragments obtained in the elution fraction are underlined by an arrow, showing the overlapping epitope fragments, confirming that the epitope fragment (59-66)-GG containing Lys63 linkage site has intensive affinity for the K63-Ub antibody. Accordingly, the affinity determination of different lysine linkage ubiquitin peptides against to ubiquitin antibody and epitope identification provide a better understanding of ubiquitin antibody related to neurogenerative diseases. Furthermore, the elucidation and analysis of antigenic ubiquitin epitopes are of crucial importance for the understanding of the binding between an antibody and an antigen and will provide a starting point for the design of diagnostic applications or for the development of new vaccines.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Ubiquitin (Ub) ist ein kleines, hochkonserviertes, aus 76 Aminosäuren bestehendes Protein, das eine wichtige Rolle in einer Reihe von intrazellulären Prozessen spielt, indem es vermittelt durch die Enzyme E1, E2 und E3 kovalent andere Proteine bindet. Ubiquitin kommt in allen eukaryotischen Zellen in Form von Mono- und Polyubiquitinketten vor, in denen Ubiquitin an das Substrat oder ein anderes Ubiquitinmolekül durch eine kovalente Bindung zwischen der ε-Aminogruppe eines internen Lysins mit dem C-terminalen Glycin einer weiteren Ubiquitineinheit verknüpft ist. Ubiquitinketten werden durch Bildung einer Isopeptidbindung zwischen der ε-Aminogruppe eines internen Lysinrests und der C-terminalen Carboxylgruppe eines weiteren Ubiquitinmoleküls gebildet. Ubiquitin enthält sieben Lysinreste (Lys 6, 11, 27, 29, 33, 48 und 63), von denen jeder in der oben dargestellten Art und Weise zu unterschiedlichen Polyubiquitinketten modifiziert werden kann. Es ist bekannt, dass der spezifische Lysinrest in Ubiquitin, welcher am Aufbau der Polyubiquitinkette beteiligt ist, deren biochemische und biologische Funktion determiniert. Deshalb ist eine detaillierte Untersuchung der Struktur-Funktionsbeziehung der entsprechenden Ubiquitinkonjugate nötig. Beispielsweise dienen über Lys48 verbundene Polyubiquitinketten als Signal, welches das markierte Protein für den proteolytischen Abbau durch das 26S Proteasom markiert, wohingegen über Lys63 verbundene Polyubiquitinketten in Verbindung mit nicht-proteolytischen Prozessen stehen. Eine interessante Möglichkeit beruht auf der Tatsache, dass unterschiedliche Funktionen unterschiedlicher Polyubiquitinketten durch Proteine vermittelt werden, die ihrerseits selektiv mit der entsprechenden Kette reagieren. Das gegenwärtige Wissen über Strukturen, biochemische Aktivitäten und biologische Funktionen von Polyubiquitinketten, die sich in isomeren Verzweigungsstrukturen unterscheiden, ist zurzeit noch recht begrenzt. Da geeignete Hilfsmittel wie die Herstellung definierter Polyubiquitinketten, Synthese und Strukturanalyse dieser Konjugate, sowie Antikörper mit hoher Spezifität für definierte Polyubiquitinketten („Bindungsstruktur-spezifische Antikörper“) bisher fehlen oder nicht bekannt sind, ist deren Entwicklung Gegenstand dieser Arbeit.


Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Reihe von chemisch definierten Polyubiquitinketten auf chemischem und biochemischem Weg synthetisiert, die sich im zur Ub-Ub-Konjugation verwendeten Lysinrest unterscheiden, und mittels Hochleistungsmassenspektrometrie charakterisiert. Fortgeschrittene Methoden von halbautomatischer Festphasenpeptidsynthese und chemoselektiver Ligation wurden entwickelt und erfolgreich zur Herstellung und molekularen Charakterisierung von linearem Ubiquitin und Polyubiquitinketten eingesetzt. Dem chemoselektiven Ligations-Ansatz folgend wurde die Ubiquitin-Konjugationsreaktion unter schwach alkalischen Bedingungen in Lösung zwischen einem N-chloroacetylierten Ubiquitinmolekül und einer Ubiquitineinheit, welche ein Cystein mit einer freien Thiolgruppe in der Aminosäuresequenz enthält, mittels Thioetherbindung durchgeführt. Das rekombinante "Donor"-Ubiquitin, in welchem das C-terminale Glycin durch Cystein ersetzt ist, wurde mittels eines bakteriellen Expressionssystems hergestellt, wohingegen das synthetische "Akzeptor"-Ubiquitin, bei dem die N-terminale Aminogruppe chloroacetyliert ist, manuell auf TGA-Resin nach Fmoc-Schutzgruppenstrategie hergestellt wurde. Dieser Ansatz wurde erfolgreich bei der Synthese linearer (Mono-)Ubiquitinkonjugate eingesetzt, die als Bausteine in der Synthese verzweigter Lys63-NH2-verbundener Di-Ubiquitinkonjugate eingesetzt werden. Ein simultaner in-situ Halogenidaustausch wurde zur Reaktion des N-chloroacetylierten Ubiquitin-Akzeptorpeptids zum reaktiveren N-iodoacetylierten Peptid durchgeführt, um die Konjugation mit der His-markierten Ubiquitin-Cys Donorkomponente durchzuführen. Beispielsweise wurden Reaktionen der linearen (Mono-)Ubiquitinkonjugate ClAc-Ub (54-76) mit His-markiertem Ub(G53C) 11, und ClAc-Ub (61-76) mit His-markiertem Ub(N60C) 12 erfolgreich durchgeführt, und die Strukturen der beiden 10,70 kDa und 10,63 kDa schweren Ubiquitinkonjugate mittels ESI-Ionenfallenmassenspektrometrie bestimmt. Um die biochemische Aktivität der synthetischen Ubiquitinkonjugate zu beurteilen, wurden die linearen (Mono-)Ubiquitinkonjugate 11 und 12 unter Verwendung der beiden Enzyme E6-AP und HectH9 in vitro durch Auto-Ubiquitinierungstests geprüft. Das synthetische, lineare Ubiquitin-Konjugationssystem weist eine ähnliche Aktivität wie das Wildtyp-Ubiquitin auf und zeigt damit die Anwendbarkeit mutierter linearer Ubiquitinanaloga, die durch Thioetherbindung verknüpft sind, bei der Herstellung biochemisch aktiver Konjugate.


Ausgehend von der Effizienz linearer (Mono-)Ubiquitinkonjugate, die durch chemoselektive Ligation synthetisiert wurden, wurde die Synthese von Oligo-Ubiquitinkonjugaten mit Verzweigungen an spezifischen Lys-ε-Aminogruppen entwickelt. Die Herstellung spezifischer, an isomeren Lys-Resten verzweigter Konjugate folgt ebenfalls dem Konzept der chemoselektiven Ligation unter Bildung chemisch stabiler Thioesterbindungen. Hierzu wurden (i) durch manuelle Synthese hergestellte N-acetylierte Akzeptorpeptide, die als Ubiquitin-Partialpeptide einen spezifischen Lys-Rest enthalten, und (ii) Thioesterbindung zu einem Ubiquitin-Donorpeptid, welches ein C-terminales Cys als definierte Konjugationsstelle enthält, eingesetzt. Dieser Synthesestrategie folgend wurde das über K63 verbundene Di-Ubiquitinkonjugat 13 erfolgreich synthetisiert und mittels HPLC, Circulardichroismus-Spektroskopie und ESI-Ionenfallen MS charakterisiert. Die gemessene Masse ist konsistent mit der berechneten 21383,97 Da und der Summenformel C932H1508N282O287S4. Dieser Ansatz zur Synthese spezifischer, über Lys verbundener Ubiquitinkonjugate stellt einen allgemeinen Weg zur Synthese von Oligo-Ubiquitinkonjugaten dar und kann genutzt werden, um (i) die biochemischen Eigenschaften isomerer Polyubiquitinkonjugate zu beurteilen, und (ii) zur Herstellung von Antikörpern, die selektiv verschiedene Ubiquitinketten abhängig von ihrer Verzweigungsstruktur an Lys erkennen.


Durch die Entwicklung rekombinanter DNA-Technologie und der Verfügbarkeit zahlreicher zellulärer Expressionssysteme ist die Herstellung von über Lys63 oder Lys48 verbundenen Di-/Tetra-Ubiquitinketten durch die Kombination von rekombinanter Proteinexpression in Escherichia coli und enzymatischer Synthese in vitro durchführbar. Diese Methode beinhaltet eine Reihe enzymatischer Reaktionen, in denen proximal und distal geschützte Monoubiquitin- (oder Ubiquitinketten-)Bausteine konjugiert werden. Dabei kann eine spezifische Ubiquitinkette in hoher Ausbeute synthetisiert werden. Die einzelnen Ketten werden anschließend entschützt und können für weitere Konjugationsreaktionen eingesetzt werden. Zur erfolgreichen Strukturanalyse der über unterschiedliche Lys-Reste verbundenen Ubiquitinkonjugate werden leistungsfähige und empfindliche analytische Methoden wie Massenspektrometrie (z.B. MALDI-TOF, Nano-ESI und Ionenfallen-MS), CD-Spektroskopie und Molecular Modeling benötigt. Nach elektrophoretischer Auftrennung über ein 15% Tris-Tricin-Gel konnten die spezifischen Ubiquitinkonjugate mittels passiver Elution isoliert werden. Die gereinigten, über Lys48 oder Lys63 verbundenen Di-/Tetra-Ubiquitinketten wurden mittels hochauflösender FT-ICR Massenspektrometrie charakterisiert. Aus den Ladungsverteilungen erhält man nach Dekonvolution folgende experimentelle Molekülmassen, die jeweils konsistent mit den berechneten Massen sind:
K63 Di-Ub - mexp = 17157,25 Da, mcalc = 17157,39 Da

K63 Tetra-Ub - mexp = 34330,38 Da, mcalc = 34326,40 Da

K48 Di-Ub - mexp = 17201,18 Da, mcalc = 17201,29 Da


Eine vergleichbare Kombination aus hochauflösender Massenspektrometrie und CD-Spektroskopie wurde erfolgreich zur Unterscheidung der Konformationen definierter, über Lys48 und Lys63 verbundener Di-Ubiquitinkonjugate eingesetzt. Für eine strukturbasierte Differenzierung sind konformationsspezifische Methoden notwendig. Ionenmobilitätsmassenspektrometrie (IM-MS) wurde in jüngster Zeit als eine höchst effiziente Technik zur Trennung und Identifizierung von unterschiedlichen Strukturen und deren Übergängen in der Gasphase entwickelt. Die Untersuchung der Gasphasenstrukturen von Proteinen kann zu einem verbesserten Verständnis von intramolekularen Wechselwirkungen beitragen, die eine bedeutende Rolle bei der Proteinfaltung spielen. Deshalb ist die Trennfähigkeit der IMS komplementär zur massenspektrometrischen Analyse. Der Vergleich der Strukturen von über Lys48 und Lys63 verknüpften Di-Ubiquitinkonjugaten zeigt, dass die über Lys63 verknüpfte Kette eine deutlich gestrecktere Konformation annimmt als das über Lys48 verknüpfte Konjugat. Die Verteilung der Stoßquerschnitte scheint für kompakte Strukturen, wie sie für die Ladungszustände +13 bis +17 bei beiden Konjugaten vorkommen, identisch, wohingegen gestreckte Konformere deutliche Unterschiede abhängig von ihren spezifischen Lysin-ε-Aminoverknüpfungen aufweisen. Gestreckte Konformere kommen bei beiden Konjugaten in den Ladungszuständen +14 bis +19 vor, wobei die Stoßquerschnitte von ~ 3100 Å2 bei [K48 Di-Ubiquitin + 14H]14+ bis ~ 3700 Å2 für [K63 Di-Ubiquitin + 19H]19+ reichen. Für gestreckte Konformere in den entsprechenden Ladungszuständen liegen die Stoßquerschnitte von über K63 verknüpftes Di-Ubiquitin im Mittel 3,5% über den entsprechenden Werten für das über K48 verknüpfte Konjugat. Daraus folgt, dass über K48 verknüpfte Konjugate eine kompaktere Struktur als die via K63 verknüpften Analoga annehmen. Die Ergebnisse der Ionenmobilitäts-MS-Studie sind in kompletter Übereinstimmung mit einer vergleichenden Molecular Modeling-Untersuchung von über Lys63 und Lys48 verknüpfte Konjugate, die auf eine kompaktere Konformation des über Lys48 verknüpften Konjugats hinweist, welche für den proteasomalen Abbau des Substratproteins determiniert. Diese Ergebnisse für Gasphasenstrukturen stimmen mit NMR-spektroskopisch bestimmten Strukturen in Lösung überein. Die Charakterisierung der Strukturen von Proteinen in Abwesenheit von Lösungsmittel ist insbesondere attraktiv im Hinblick auf (i) den Vergleich von Gasphasenstrukturen mit Strukturen in Lösung, woraus Informationen über Strukturbeeinflussung durch Lösungsmittelmoleküle gewonnen werden können, und (ii) die Perspektive neuer analytischer Techniken zur Strukturbestimmung von Mischungen von Proteinen unterschiedlicher Konformationen.


Im letzten Teil der Arbeit wurde die Interaktion von synthetischen, über Lys verknüpften Ubiquitinkonjugaten mit einem monoklonalen, K63-verknüpfungsspezifischen Ubiquitin-Antikörper (Klon HWA4C4) mittels Affinitätsmassenspektrometrie und Immunblot-Techniken wie Dot Blot und Western Blot untersucht. Diese immunanalytischen Methoden sind wertvolle Hilfsmittel zur Charakterisierung der Spezifität der Erkennung unterschiedlicher Ubiquitinkonjugate. Die affinitätsmassenspektrometrischen Daten bestätigen die Bindung synthetischer Ubiquitinpeptide, die jeweils Lys63 in ihren Sequenzen enthalten, mit dem K63-verzweigungsspezifischen Antikörper. Die Dot Blot-Experimente zeigen darüber hinaus Interaktion dieses Antikörpers mit Peptiden, die Lys6 oder Lys63 enthalten, an deren ε-Aminogruppen sich jeweils ein Gly-Gly-Dipeptid befindet. Im Gegensatz dazu konnte mit analogen Ubiquitin-Partialpeptiden, die in ihren Sequenzen Lys11, Lys33 und Lys48 enthalten, keine Bindung des Antikörpers festgestellt werden. Durch Western Blot-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der K63-verknüpfungsspezifische Antikörper nur mit rekombinanten, über K63 verknüpften Di-/Tetra-Ubiquitinkonjugaten eine intensiv positive Reaktion zeigt, nicht hingegen mit den Negativkontrollen Ubiquitin und über K48 verknüpftes Di-Ubiquitin. Alle drei angewandten Methoden liefern konsistente Ergebnisse im Hinblick auf Bindungsaffinitäten und Spezifitäten eines K63-verknüfungsspezifischen Antikörpers mit unterschiedlichen Peptiden. Die Interaktion mit dem Antikörper wird durch die Aminosäuresequenz der Peptide mit einem Lys63-Rest und deren Sekundärstruktur bestimmt. Zur massenspektrometrischen Epitopidentifizierung wurde unter Verwendung des gereinigten anti-K63-Ubiquitin-Antikörpers eine Affinitätssäule hergestellt. Die Epitopbestimmung des Peptids Ub(57-69)_K63-GG wurde mittels Exzisions- und Extraktionsexperimenten durchgeführt. Ein Vergleich der überlappenden Epitopfragmente zeigt, dass die Sequenz Ub(59-66)-GG, welche eine Verknüpfung an Lys63 trägt, eine hohe Affinität zum anti-K63-Ub Antikörper aufweist. Die Bestimmung der Affinität von über unterschiedliche Lysinreste verzweigten Ubiquitinpeptide mit einem anti-Ubiquitinantikörper und die Epitopbestimmung liefert ein vertieftes Verständnis der Funktion von Ubiquitinantikörpern in Bezug auf neurodegenerative Erkrankungen. Darüber hinaus sind Bestimmung und Analyse antigener Ubiquitinpeptide von entscheidender Bedeutung zum Verständnis der Antigen-Antikörper-Bindung und stellen einen Ausgangspunkt für diagnostische Anwendungen und die Entwicklung neuer Vakzine dar.

Fachgebiet (DDC)
540 Chemie
Schlagwörter
Ubiquitin conjugates, mass spectrometry, Ion-mobility mass spectrometry
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690JUNG, Ji Eun, 2011. Synthesis and mass spectrometric structural chracterization of ubiquitin conjugates [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Importantly, it appears that the specific lysine residue of ubiquitin used for ubiquitin-ubiquitin chain formation determines the biochemical and biological function, thus requiring a detailed chemical structure-function evaluation of the respective ubiquitin conjugates. For example, Lys48-linked polyubiquitin chains serve as a signal targeting the modified proteins for degradation by the 26S proteasome, while Lys63-linked polyubiquitin chains have been linked to non-proteolytic processes. So, an attractive possibility is that the different functions of different polyubiquitin chains are mediated by proteins that selectively interact with the respective chain. However, the present knowledge about the structures, biochemical activities, and biological functions of polyubiquitin chains differentiated by branching sites and isomeric structures is rather limited. So, this is to a major study due to the fact that appropriate tools including the preparation of defined polyubiquitin chains, the structural chracterization of these conjugates, and antibodies that are specific for defined polyubiquitin chains ("linkage-specific antibodies") are hitherto missing or not known and are difficult to develop.&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;In the first study of this thesis, a series of chemically defined polyubiquitin chains that differ by the lysine residue used for Ub-Ub conjugation was synthesized by chemical and biochemical means and characterized by high performance mass spectrometry. Advanced methods of semi-automated solid phase peptide synthesis and chemoselective ligation have been developed and successfully applied to the preparation and molecular characterization of linear ubiquitin and polyubiquitin chains. According to chemoselective ligation-based approach, the ubiquitin conjugation reaction was performed in solution, under slightly alkaline conditions, between the N-chloroacetylated ubiquitin and the ubiquitin containing one cysteine residue with a free thiol group in the sequence by thioether linkage formation. The recombinant "donor" ubiquitin in which the C-terminal amino group is replaced by a cysteine, was prepared by bacteria cell expression and the synthetic "acceptor" ubiquitin in which the N-terminal amino group is chloroacetylated was manually synthesized on TGA resin according to the Fmoc chemistry. This approach was successfully applied for the preparation of linear (mono-)ubiquitin conjugates, which will be used for moiety of branched Lys63-NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ε-linked di-ubiquitin conjugate. In-situ simultaneous halide exchange was employed for the conversion of the N-chloroacetylated to N-iodoacetylated ubiquitin acceptor peptide for increasing reactivity in order to conjugate with recombinant His-tagged ubiquitin-Cys donor component. As an example, a linear- (mono-)ubiquitin conjugatates; ClAc-Ub (54-76) with His-tagged Ub(G53C) 11, and ClAc-Ub (61-76) with His-tagged Ub(N60C) 12, were successfully prepared, and the structure of the 10.70 kDa and 10.63 kDa ubiquitin adducts ascertained by ESI ion trap mass spectrometry. To assess the biochemical activity of the synthetic ubiquitin conjugates containing a cysteine residue; the linear (mono-)ubiquitin conjugates 11, 12 were analyzed in vitro in auto-ubiquitination assays with two different enzymes (E6-AP and HectH9). The synthetic linear ubiquitin conjugation system with efficiency similar to wild-type ubiquitin, indicates the feasibility of the mutated linear ubiquitins by thioether ligation approaches in producing biochemically active conjugates.&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;Based on the performance of linear (mono-)ubiquitin conjugates by chemoselective ligation, the synthesis of oligo-ubiquitin conjugates with defined Lys-ε-amino branching sites was designed and developed. The preparation of specific isomeric Lys-branched conjugates also utilizes a chemoselective ligation approach with chemically stable thioether linkages using (i), an activated N-chloroacylated partial ubiquitin acceptor peptide containing the specific lysine linkage residue, prepared by manual synthesis, and (ii), thioether ligation to a ubiquitin donor peptide that contains a C-terminal Cys residue at the defined conjugation site. According to the strategy, K63-linked di-ubiquitin conjugate 13, was successfully prepared and characterized by HPLC, circular dichroism spectroscopy and ESI ion trap MS which was determined the average molecular weight (21383.97 Da) are consistent with the correct element formula C&lt;sub&gt;932&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;1508&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;282&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;287&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; by. The synthetic approach of specific Lys linked ubiquitin conjugates should be feasible as a general route for the preparation of oligo-ubiquitin conjugates that can be used (i), to evaluate the biochemical properties of isomeric poly-ubiquitin conjugates, and (ii), for the preparation of antibodies that selectively recognize different ubiquitin chains depending on the specific lysine residue of ubiquitin used for chain formation.&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;With the advent of recombinant DNA technology and the availability of numerous expression systems, preparation of Lys63- or Lys48- linked di-/tetra- ubiquitin chain components by recombinant Escherichia coli cell expression combination with enzymatic synthesis in vitro were efficiently available. The method involves a series of enzymatic reactions in which proximally and distally blocked monoubiquitins (or chains) are conjugated to produce a particular chain in high yield. Individual chains are then deblocked and joined in another round of reaction. To perform successful bioanalytical applications on molecular structure chracterization of different lysine linked ubiquitin conjugates, efficient and sensitive analytical methods such as a mass spectrometer with MALDI-TOF, Nano-ESI, Ion Trap, CD spectroscopy and molecular modelling were have been required. After separated by 15 % Tris-Tricine SDS-PAGE, the specific lysine linkage ubiquitin modifications were subjected by treatment of passive elution. The purified Lys48- or Lys63-linked di-/tera- ubiquitin chains were characterized by FTICR high resolution mass spectrometry, showing multiple charge distributions with experimental molecular masses of&lt;br /&gt;K63 Di-Ub - m&lt;sub&gt;exp&lt;/sub&gt; = 17157,25 Da, m&lt;sub&gt;calc&lt;/sub&gt; = 17157,39 Da&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;K63 Tetra-Ub - m&lt;sub&gt;exp&lt;/sub&gt; = 34330,38 Da, m&lt;sub&gt;calc&lt;/sub&gt; = 34326,40 Da&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;K48 Di-Ub - m&lt;sub&gt;exp&lt;/sub&gt; = 17201,18 Da, m&lt;sub&gt;calc&lt;/sub&gt; = 17201,29 Da&lt;br /&gt;.&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;A comparative application of high resolution mass spectrometry together with CD spectroscopy has been successfully applied for the conformational differentiation of defined Lys48- and Lys63-linked di-ubiquitin conjugates, conformation-specific methods are required for structural bases distinguishing of different specific lysine linked di-ubiquitin conjugates. Ion mobility mass spectrometry (IM–MS) has been recently emerging as a highly effective tool for the separation and identification of structural transitions of ubiquitin ions in the gas phase. Investigating gas-phase structures of protein ions can lead to an improved understanding of intramolecular forces that play an important role in protein folding. Hence, the separative capacity of IMS is highly complementary to MS analysis. The structural comparison of Lys48- and Lys63-linked di-ubiquitin conjugates showed that, Lys63 linked chain is considerably more elongated than Lys48 linked chain. Collisional cross-section distributions appear identical for compact structures that exist for the +13 to +17 charge states of both conjugates, while elongated conformers showed distinct differences for the specific lysine-ε-amino linkages. Elongated conformers exist for both types of conjugates in the cross-section distributions of charge states +14 to +19, with collisional cross-sections for these ions ranging from ~3100 Å2 for [K48 di-ubiquitin +14H]&lt;sup&gt;14+&lt;/sup&gt; to ~3700 Å&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; for [K63 di-ubiquitin +19H]&lt;sup&gt;19+&lt;/sup&gt;. For the elongated charge states of conformers, cross-sections of K63 linked di-ubiquitin are on average 3.5 % larger than those of K48 linked di-ubiquitin, indicating that K48 linked conjugates adopt a more compact structure than K63 linked conjugates. The ion mobility-MS results were in full agreement with a comparative molecular modeling study of the Lys63- and Lys48- linked conjugates, suggesting a more compact Lys48 linked conformation to be required for targeting conjugated substrate proteins for proteolytic, proteasome degradation. These results of the gas phase structures are consistent with previous NMR spectroscopy data in solution phase. Characterizing the structures of proteins in the absence of solvent is suggested to be useful for (і), the comparison of gas-phase results with structural information from solution provides insight about how solvent interactions influence structure; (іі), the characterization of gas phase ion structures may become an important factor in the development of new analytical techniques for studying mixtures of proteins conformers.&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;In the last part of the thesis, the binding of synthesized specific Lys linked ubiquitin conjugates to the monoclonal specific K63 linkage ubiquitin antibody (clone HWA4C4) was studied by affinity-mass spectrometry, immunoblotting methods such as dot blot and western blot. These immuno-analytical techniques were a powerful tool for characterising recognition specificities of different lysine linked ubiquitin conjugates. Affinity-MS data proved the binding of the synthetic ubiquitin peptides containing in their sequences a lysine63 residue to the K63 linkage ubiquitin antibody. The results of the dot blot test confirmed the specifically binding of the K63-Ub antibody to the partial ubiquitin peptides containing Lys6 or Lys63 attached to a Gly-Gly dipeptide. In contrast, for partial ubiquitin sequences contained the Lys11, Lys33 and Lys48 were no response observed. And also Western blot observed that the K63 linkage ubiquitin antibody gave an intense positive response only for the recombinant K63-linked di-/tetra- ubiquitin conjugates but no response for control ubiquitin and K48-linked di-ubiquitin. The comparison of the three methods provided consistent results to reveal differences in binding affinities and specificities by the K63 linkage ubiquitin antibody, showing that antibody binding is influenced by ubiquitin peptides containing in their sequences a lys63 residue and its secondary structure. For mass spectrometric epitope identification, an affinity column was prepared using the purified K63-Ub antibody. The epitope elucidation of Ub(57-69)_K63-GG peptide was accomplished by excision and extraction experiments. The results indicate that the fragments obtained in the elution fraction are underlined by an arrow, showing the overlapping epitope fragments, confirming that the epitope fragment (59-66)-GG containing Lys63 linkage site has intensive affinity for the K63-Ub antibody. Accordingly, the affinity determination of different lysine linkage ubiquitin peptides against to ubiquitin antibody and epitope identification provide a better understanding of ubiquitin antibody related to neurogenerative diseases. Furthermore, the elucidation and analysis of antigenic ubiquitin epitopes are of crucial importance for the understanding of the binding between an antibody and an antigen and will provide a starting point for the design of diagnostic applications or for the development of new vaccines.</dcterms:abstract>
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April 20, 2011
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