The Na,K-ATPase is an integral membrane protein present in virtually all animal cells, where it actively transports Na+ and K+ ions across the plasma membrane using ATP as energy source. For every ATP molecule hydrolyzed, the enzyme pumps three Na+ ions out of and two K+ ions into the cell. Because of its fundamental role in many physiological processes, the Na,K-ATPase is the target of specific regulatory mechanisms. Among them, the enzyme is modulated by the interaction with the so-called FXYD proteins, a group of short transmembrane polypeptides named after the invariant extra¬cellular motif FXYD. All mammalian members of the FXYD family are known to associate with the Na,K-ATPase and modulate its properties in a tissue- and isozyme-specific way. FXYD1, also known as phospholemman, has been first identified as the major substrate for protein kinases A and C in the heart. Subsequently, it has been discovered to associate with specific isozymes of the Na,K-ATPase and modulate the enzyme activity in heart and skeletal muscle as well as kidneys and brain.
So far, the effects of FXYD1 on the Na,K-ATPase have been investigated mainly in intact cells, both heterologous systems and native cells. These systems allow a better characterization of the physiological effects of FXYD1, but are of limited use for the investigation of the functional and structural interactions between FXYD1 and the enzyme. A purification procedure of the human α1/His10-β1 and α2/His10-β1 isozymes of the Na,K-ATPase expressed in yeast P. pastoris has been recently developed by the group of Steven Karlish at the Weizmann Institute of Science. The purified, detergent-solubilized α1/His10-β1 can be in vitro reconstituted with purified, detergent-solubilized human FXYD1 expressed in E. coli to obtain the α1/His10-β1/FXYD1 complex. The purified recombinant preparations provide a system that enables us to work under well defined conditions and without interference by other cellular components. Unlike in native cells, the effects of FXYD1 on the different isozymes of the Na,K-ATPase can be investigated separately. Moreover, since the phosphorylation state of FXYD1 in the purified preparations is easily controllable, the functional role of the protein kinases-mediated phosphorylation of FXYD1 can be investigated. Therefore, these systems allow the performance of a detailed functional analysis of the effects of FXYD1 on the Na,K-ATPase.

The biophysical techniques based on the fluorescence of external dyes available in our lab allow a thorough characterization of the transport cycle of the Na,K-ATPase. Among them, the electrochromic styryl dye RH421 enables us to monitor the ion movements inside the membrane domain of the enzyme, allowing the detection of ion binding and ion release during the transport cycle. Moreover, the time course of the signals provides information about the kinetics of the processes involved. In contrast, the voltage-sensitive dye Oxonol VI can be successfully applied to detect the ion transport of the Na,K-ATPase reconstituted in lipid vesicles.

In a first step of the current study, the dye RH421 has been applied to the purified α1/His10-β1 and α2/His10-β1 preparations to ensure that it is suitable to investigate the ion-binding kinetics of detergent-solubilized ion pumps and that the functional properties of the purified recombinant enzymes do not differ significantly from those of the membrane-bound native Na,K-ATPase. Afterwards, the dye RH421 has been applied in steady-state and time-resolved kinetic measurements to characterize the effects of FXYD1 on the different partial reactions of the transport cycle of the α1/β1 isozyme of the Na,K-ATPase. These experiments have shown a single kinetic property affected by the presence of FXYD1: in both the enzyme conformations, E1 and P-E2, the Na+-binding affinity is increased of ~ 20-30%. In the final part of the study, the influence of the membrane and its lipid composition on the effect of FXYD1 on the Na+-binding affinity of the enzyme has been investigated with the voltage-sensitive dye Oxonol VI in proteoliposomes containing either α1/His10-β1 or α1/His10-β1/FXYD1. These experiments have revealed an unexpected role of the lipid environment surrounding the complex in the interaction of FXYD1 with the enzyme, probably related to the cytoplasmic segment of the regulatory protein.

Die Na,K-ATPase ist ein integrales Membranprotein in allen tierischen Zellen, in denen sie Na+- und K+-Ionen durch die Plasmamembran befördert und dabei ATP als Energie¬quelle benutzt. Für jedes hydrolysierte ATP-Molekül befördert das Enzym drei Na+-Ionen aus und zwei K+-Ionen in die Zelle. Wegen ihrer grundlegende Rolle bei vielen physiologischen Prozessen ist die Na,K-ATPase das Target von spezifischen regulatorischen Mechanismen. Unter diesen gibt es eine Enzymmodulation durch die Wechselwirkung mit den sogenannten FXYD Proteinen, eine Gruppe von kurzen Transmembran-Polypeptiden, die nach einem invarianten extrazellulären Motiv ‘FXYD‘ benannt sind. Von allen Mitgliedern der FXYD-Familie in Säugetieren ist bekannt, dass sie mit der Na,K-ATPase assoziieren und deren Eigenschaften in einer Gewebe- und Isozym-spezifischen Weise modulieren. FXYD1, auch als Phospholemman bekannt, ist zuerst als das wichtigste Substrat für die Proteinkinasen A und C im Herz identifiziert worden. Erst anschließend wurde es entdeckt, dass es mit Isozy-men der Na,K-ATPase assoziiert und die Enzymaktivität in Herz- und Skelettmuskeln sowie in der Niere und im Gehirn moduliert.

Bis jetzt ist die Effekte von FXYD1 an der Na,K-ATPase hauptsächlich in intakten Zel-len, sowohl an heterologen Systemen und nativen Zellen untersucht worden. Diese Systeme ermöglichen eine gute Charakterisierung der physiologischen Effekte von FXYD1, aber sie sind nur von begrenztem Nutzen für die Untersuchung der funktionellen und strukturellen Wechselwirkungen zwischen dem Enzym und FXYD1. Eine Reinigungsprozedur für die menschlichen α1/His10-β1 und α2/His10-β1 Isozyme der Na, K-ATPase, exprimiert in der Hefe P. pastoris, ist kürzlich von der Gruppe von Steven Karlish am Weizmann Institute of Science entwickelt worden. Das gereinigte, solubilisierte α1/His10-β1 Enzym kann in vitro mit gereinigtem, solubilisierten menschlichem FXYD1, das in E. coli exprimiert worden ist, rekonstituiert werden, um den α1/His10-β1/FXYD1-Komplex zu erhalten. Die gereinigten, rekombinanten Präparationen stellen ein System dar, das erlaubt, unter genau definierten Bedingungen und ohne Störung durch andere zelluläre Komponenten zu arbeiten. Im Gegensatz zu nativen Zellen können an den rekombinanten Präparationen die Effekte von FXYD1 auf die verschiedenen Isozyme der Na,K-ATPase separat untersucht werden. Weil die Phosphorylierung von FXYD1 in den gereinigten Präparationen gut steuerbar ist, kann auch die funktionale Rolle der Proteinkinasen-vermittelte Phosphorylierung von FXYD1 untersucht werden. Daher ermöglichen diese Systeme eine detaillierte Analyse der funktio-nalen Effekte von FXYD1 auf die Na,K-ATPase.

Die in unserem Labor etablierten biophysikalischen Techniken mit extrinsischen Fluo-reszenzfarbstoffen ermöglichen eine gründliche Charakterisierung des Transport-Zyklus der Na,K-ATPase. Der elektrochrome Styrylfarbstoff RH421 erlaubt, die Ionenbewegungen in der Membrandomäne des Enzyms zu verfolgen, um Ionenbindung und -freisetzung während des Transportzyklus zu ermitteln. Darüber hinaus liefert der zeitliche Verlauf der Signale Information über die Kinetik der Prozesse. Im Gegensatz dazu wurde der potenzial-sensitive Farbstoff Oxonol VI erfolgreich eingesetzt, um den Ionentransport der Na,K-ATPase, die in Lipidvesikeln rekonstituiert wurde, erfolgreich zu ermitteln.

In einem ersten Schritt wurde in der vorliegenden Studie der Farbstoff RH421 eingesetzt, um an den gereinigten α1/His10-β1 und α2/His10-β1 Isozymen nachzuweisen, dass es möglich ist, an solubilisierten Ionenpumpen die Ionen-Bindungskinetik zu untersuchen, und dass die funktionellen Eigenschaften der gereinigten, rekombinanten Enzyme nicht wesentlich von denen der Membran-gebundenen, nativen Na, K-ATPase verschieden sind. Danach wurde der Farbstoff RH421 in stationären und zeitaufgelösten, kinetischen Messungen eingesetzt, um die Effekte von FXYD1 auf die verschiedenen Teilreaktionen des Transportzyklus des α1/β1-Isozyms der Na, K-ATPase zu charakterisieren. Diese Versuche haben gezeigt, dass nur eine einzige kinetische Eigenschaft der Na,K-ATPase in der Anwesenheit von FXYD1 beeinflusst ist, die Na+-Bindungsaffinität. Diese ist sowohl in der E1- als auch P-E2-Konfor¬mation um ~ 20-30% verstärkt. Im letzten Teil der Studie wurde der Einfluss der Membran- und ihre Lipidzusammensetzung auf den Effekt von FXYD1 auf die Na+-Bindungsaffinität des Enzyms in Proteoliposomen mit dem potenzialsensitiven Oxonol VI untersucht. Dabei wurden α1/His10-β1 oder α1/His10-β1/FXYD1 Komplexe verglichen. Diese Versuche haben eine unerwartete Rolle des umgebenden Lipids auf die Wechselwirkung zwischen FXYD1 und dem Enzym erkennen lassen, die wahrscheinlich auf das zytoplasmatische Segment des regulatorischen Proteins zurückzuführen ist.