DNA replication is an essential process whereby an entire double-stranded DNA is copied to produce a second, identical DNA double helix. This process requires the concerted action of a large number of proteins. The basic mechanism governing this vital macromolecular event is conserved among prokaryotes, archaea and eukaryotes. The helicase unwinds the DNA double helix into two individual strands. Single strand binding proteins coat the single-stranded DNA to prevent the strands from reannealing. Primase is a polymerase that synthesizes the short primers needed to start the replication process. Primases are necessary because DNA polymerases can only extend a nucleotide chain, not start one. The DNA polymerase starts at the 3’ end of the primer, and, using the original strand as a template, begins to synthesize a new complementary DNA strand by linking the 5’ phosphate group of an incoming nucleotide to the 3’ hydroxyl group at the end of the growing nucleic acid chain.

The studies presented in this thesis are described in three recently published papers. In the publication titled “ Properties of the human Cdc45/Mcm2-7/GINS helicase complex and its action with DNA polymerase ε in rolling circle DNA synthesis”, we describe the purification and biochemical characterization of the human replicative DNA helicase, the CMG complex, which consists of Cdc45, Mcm2-7 and GINS. Another manuscript (“Characterization of the DNA primase complex isolated from the archaea, Thermococcus kodakaraensis”) focuses on the archaeal DNA primase, which consists of a small catalytically active subunit and large regulatory subunit devoid of enzymatic activity. While this structure is similar to the eukaryotic DNA primase, we found that the archaeal complex initiates DNA as well as RNA chains de novo, while the eukaryotic complex only initiates RNA chains. Finally, we studied the biochemical properties of a previously uncharacterized nuclease that localizes to the replication components (“A novel DNA nuclease is stimulated by association with the GINS complex”).

Classically, the enzymes involved in replication have been characterized under conditions in which each protein is examined in the absence of other replication components. Rolling circle assays have been recently developed for prokaryotic systems to study the jointly action of replication proteins during DNA synthesis. The primase and the CMG studies presented in this thesis describe the development of an in vitro rolling circle method used to examine leading and lagging strand synthesis with both archaeal and eukaryotic proteins. Our detailed studies in the eukaryotic system revealed that the putative leading strand polymerase ε, in concerted action with the helicase, supported the synthesis of long DNA chains while DNA polymerase δ, the putative polymerase involved in lagging strand synthesis, did not support the synthesis of long DNA chains.

Overall, the availability of rolling circle assays will be of great advantage in analyzing the functions played by the various components of the DNA replication machinery of human cells.

DNA-Replikation ist ein zentraler Prozess, mit dem die gesamte doppelsträngige DNA-Helix zu einer zweiten, identischen DNA-Doppelhelix kopiert wird. Bei diesem Vorgang, der bei Bakterien über Archaeen bis hin zu Eukaryoten beibehalten ist, muss eine Vielzahl von Proteinen zusammenspielen.

Bei der DNA-Replikation wird die DNA-Doppelhelix von der Helikase in zwei unabhängige Stränge entwunden, die dann durch Einzelstrangbindeproteine bedeckt werden, um das Wiederverschmelzen der Einzelstränge zu verhindern. Die Primase, eine Polymerase, die Nukleotidketten beginnen kann (während DNA-Polymerasen diese lediglich verlängern können), synthetisiert die für den Replikationsstart notwendigen Primer. Die DNA-Polymerase beginnt dann am 3’-Ende des Primers mit der Synthese eines neuen komplementären DNA-Stranges, bei dem der Originalstrang als Matrize verwendet wird. Dazu verbinden die Polymerasen die 5’-Phosphatgruppe des neuen Nukleotids mit der 3’-Hydroxylgruppe am Ende der wachsenden Nukleotidkette. Durch die Polarität der DNA kann ein DNA-Strang (der Leitstrang) kontinuierlich, der andere Strang (der Folgestrang) diskontinuierlich repliziert werden.

Die in der vorliegenden Dissertation präsentierten Studien wurden in drei jüngst publizierten Veröffentlichungen beschrieben. Thema der Publikation “Properties of the human Cdc45/Mcm2-7/GINS helicase complex and its action with DNA polymerase ε in rolling circle DNA synthesis.” ist die Aufreinigung und biochemische Charakterisierung der humanen Replikationshelikase, die aus dem Cdc45-Protein, dem Mcm2-7- und dem GINS-Komplex besteht und kurz CMG-Komplex genannt wird. In einem weiteren Manuskript (“Characterization of the DNA primase complex isolated from the archaeon, Thermococcus kodakaraensis.”) wird die archaeelle DNA-Primase behandelt, die aus einer kleinen, katalytisch aktiven und einer großen, regulatorischen Untereinheit besteht. Obwohl die Struktur der archaeellen Primase der der eukaryotischen ähnelt, wurde aufgewiesen, dass die archaeelle Primase Nukleotidketten sowohl mit DNA als auch RNA beginnen kann, während die eukaryotische Primase ausschließlich RNA zum Start von Nukleotidketten verwendet. In “A novel DNA nuclease is stimulated by association with the GINS complex” wurden ferner die biochemischen Eigenschaften einer bislang unbekannten, mit Replikationsproteinen interagierenden Nuklease untersucht.

Üblicherweise wurden die Enzyme der DNA-Replikation unabhängig voneinander, also in Abwesenheit anderer Replikationsproteine, untersucht. In jüngerer Vergangenheit wurden für eine Reihe prokaryotischer Systeme jedoch Rolling-Circle-Experimente entwickelt, um das Zusammenspiel der verschiedenen replikativen Enzyme auf einem zirkulären DNA-Substrat zu untersuchen. In den in der vorliegenden Arbeit präsentierten Primase- und CMG-Studien wird die Entwicklung einer Rolling-Circle-Methode beschrieben, mit der die Leit- und die Folgestrangsynthese durch archaeelle und eukaryotische Proteine untersucht werden können. Durch diese Studie mit dem eukaryotischen System wurde aufgewiesen, dass nur die vermutliche Leitstrangpolymerase ε, zusammen mit der humanen Helikase CMG, die Rolling-Circle-Synthese unterstützte, während die, vermutlich den Folgestrang kopierende, DNA-Polymerase δ keine langen DNA-Fragmente im Rolling-Circle-Ansatz produzieren konnte.

Da die Rolling-Circle-Methode nun für die archaeellen und eukaryotischen Systeme zur Verfügung steht, können weitere Zusammenhänge zwischen Replikationsproteinen detailliert in vitro analysiert werden.