Aarskog-Scott synrdome (AAS) or Faciogenital Dysplasia (FGDY) is a developmental orphan disorder primarily characterized by skeletal dysplasia and genital abnormalities. The pathomechanism of the disease is poorly understood owing to genetic heterogeneity, clinical overlap with other disorders and the relatively low incidence. AAS is an X-chromosomelinked recessive disorder affecting mainly males, although autosomal dominant and autosomal recessive inheritance has been also reported. The only known disease causing factor responsible for the X-linked form of AAS is the Faciogenital Dysplasia Protein 1 (FGD1). FGD1 is a guanine nucleotide exchange factor for CDC42, a member of the Rho family of small GTPases. FGD1 has been reported to modulate secretion and cytoskeletal reorganization, however, the role of FGD1 in AAS syndrome is largely unknown.



In this work, first the expression profile of the mouse Fgd1 was investigated during embryogenesis and in more than twenty adult tissues. According to the literature, Fgd1 exhibits an expression pattern restricted to differentiating osteoblasts in the mouse embryo. In contrast, using sensitive in situ hybridization and immunohistochemistry with newly developed anti-Fgd1 antibodies, a much broader expression spectrum of Fgd1 was identified in the present work. Strong Fgd1 expression was seen in the developing nervous system and in the limb bud as early as embryonic days 11.5. Detailed analysis at later embryonic stages confined Fgd1 to
multiple organs including cartilage, heart, kidney, muscle and the intestine. Confirming the ubiquitous expression pattern, Fgd1 was detected in nearly all postnatal organs. Fgd1 was found in neuronal and interneuronal cells of the central nervous system and nuclear layers of the retina. Primarily epithelial cells express Fgd1 in the endocrine (pancreas), the respiratory (trachea and lung) and the digestive (salivary glands, colon and liver) systems. Fgd1 was prominent in the cardiovascular system, the male (testis, epididymis and prostate) and the female (ovary and uterus) reproductive systems. Furthermore, Fgd1 was detected the genitourinary system (kidney and urinary bladder), the hematopoietic system (bone marrow and spleen), lymphatic system (thymus), in the skin and in the musculoskeletal system (bone, cartilage, ligaments and skeletal muscle). Thus, the previously unrecognized expression pattern
suggests that Fgd1 plays a general role in most organs of the body and its function is not restricted to osteoblasts.



In order to elucidate the function of FGD1 in vitro, small hairpin RNA (shRNA)-mediated FGD1 knock down in various human cell lines was performed. Analysis of the osteoblastic SaOs2 and the fibroblastic HT1080 carcinoma cell lines demonstrated that FGD knock down impairs cell proli feration and adhesion to extracellular matrix proteins. FGD1-deficiency resulted in slow proli feration rate owing to reduced progression through the G1 phase of the cell cycle. The attachment assays revealed that a lack of FGD1 leads to reduced integrin mediated adhesion to fibronectin, collagen type I, lamin in and vitronectin in varying extent.



Genetically modified mice are essential tools deciphering the pathomechanisms of human disorders. In order to correlate Fgd1 function with the clinical symptoms of AAS, establishing mouse model(s) for the disease was a general aim of this thesis. As a first attempt, a constitutive
gene targeting strategy was applied in murine R1 embryonic stem (ES) cells. Despite a large scale screening, no homologous recombinant ES cell clone was identif ied. The Fgd1 gene is localized on the X chromosome and its null mutation results in functional knock out already in R1 ES cells, which were derived from male embryos. The unsuccessful constitutive targeting implies that Fgd1 may play a role in stem cells and in preimplantation development. This hypothesis was proved by demonstrating the expression of Fgd1 in ES cells and in early stage embryoid bodies. To overcome the likely negative effect of Fgd1-deficiency in constitutively targeted ES cells, a conditional targeting strategy was applied. ES cells with the floxed Fgd1 gene were generated that can be used to establish transgenic mice.



The expression pattern of Fgd1 in tendons and ligaments suggests that swan-neck deformity of the fingers, a primary criterion of AAS, can be treated by operating the ligaments. In this
work it is shown that Littler tenodesis, an operative intervention commonly used for rheumatoid swan-neck deformity, can also be applied to restore the oblique reticular ligament in Aarskog-Scott associated swan-neck deformity. A 28-year old AAS-patient was operated and
intensively analyzed after the operation. By monitoring the sensitivity, joint movement and grip strength, the full recovery of all parameters was demonstrated.

Das Aarskog-Scott Syndrom (AAS) oder auch Fazio Genitale Dysplasie (FGDY) ist eine seltene Entwicklungsstörung, die primär durch Skelettdysplasie und genitale Anomalien charakterisiert ist. Auf Grund genetischer Heterogenität, klinischer Überlagerung zu anderen Syndromen und der Seltenheit der Erkrankung ist der Pathomechanismus nur schlecht verstanden.
AAS ist eine X-chromosomal rezessive Erkrankung, von der hauptsächlich Männer betroffen sind, obwohl auch autosomal dominante und autosomal rezessive Vererbung beschrieben wurden. Der einzige bekannte Krankheitsfaktor für die X-chromosomal vererbte Form des AAS ist das Fazio Genital Dysplasie protein 1 (FGD1). FGD1 ist ein Guanin Nukleotide Austauschfaktor für CDC42, ein Mitglied der Rho-Familie der kleinen GTPasen. Für FGD1 wurde eine Funktion als Sekretionsmodulator und in der Reorganisierung des Cytoskeletts beschrieben, dennoch ist die Funktion des FGD1 im AAS weitestgehend unbekannt.



In dieser Dissertation wurde zunächst das Fgd1 Expressionsprofil in der Maus während der Embryogenese und in mehr als zwanzig adulten Geweben untersucht. In der Literatur ist beschrieben, dass sich das Fgd1 Expressionsprofil auf die sich differenzierenden Osteoblasten im Mausembryo beschränkt. Im Gegesatz dazu konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von sensitiver in situ-Hybridiserung und Immunhistochemie mit einem selbst hergestellten Fgd1 Antikörper ein viel breiteres Fgd1 Expressionsmuster nachgewiesen werden. So konnte eine starke Fgd1 Expression im sich entwickelnden Nervensystem und in den Beinansätzen bereits am embryonalen Tag 11.5 gezeigt werden. Eine detailierte Analyse späterer Embryonalstadien ergab eine Fgd1 Expression in diversen Organen, unter anderem in Knorpel, Herz, Niere, Muskel und Darm. Fgd1 wurde in nahezu allen postnatalen Geweben nachgewiesen, so dass man von einem ubiquitären Expressionsprofil sprechen kann. Fgd1 wurde in neuronalen und interneuronalen Zellen des Nervensystems und in den Nuklearschichten der Retina gefunden.
In erster Linie exprimieren Epithelzellen im Endokrinen- (Pankreas), Atmungs- (Trachea und Lunge), und im Verdauungssystem (Speicheldrüse, Darm und Leber) Fgd1. Auch im kardiovaskulären
System, im männlichen (Hoden, Nebenhoden und Prostata) und weiblichen (Ovarien und Uterus) Fortpflanzungsapparat zeigte sich eine starke Expression. Darüber hinaus wurde Fgd1 im Urogenitaltrakt (Niere und Harnblase), dem hämatopoetischen System (Knochenmark und Milz), dem lymphatischen System (Thymus), in der Haut und im muskuloskelettalen System (Knochen, Knorpel, Ligament und skelettalen Muskel) detektiert. Dieses zuvor nicht beschriebene Expressionsmuster weißt auf eine fundamentale Rolle von Fgd1 in den
meisten Organen des Körpers hin.



Um die Funktion von FGD1 in vitro zu entschlüsseln, wurde ein ein Small hairpin RNA (shRNA) vermittelter FGD1 knock down in verschiedenen humanen Zelll inien durchgeführt. Dieser beeinträchtigte in osteoblastischen SaOs2 und in fibroblastischen HT1080 Karzinomazellen die Proliferation und Adhäsion an extrazelluläre Matrixproteine. Der Verlust von FGD1 resultiert in einer verlangsamten Zellteilung auf Grund einer reduzierten G1 Progression durch die G1 Phase des Zellzyklus. Attachment Assays zeigten eine reduzierte Integrin vermittelte Adhäsion in unterschiedlicher Ausprägung an Fibronektin, Kollagen Typ I, Laminin und Vitronektin.



Genetisch veränderte Mäuse sind ein grundlegendes Werkzeug zur Aufklärung menschlicher Erkrankungen. Um die Fgd1 Funktion in den klinischen Symptomen des AAS zu ergründen, sollten Mausmodell(e) für diese Erkrankung hergestellt werden. Zunächst wurde eine konstitutive Gentargeting Strategie in R1 embryonalen Stammzellen (ES) der Maus durchgeführt. Trotz eines groß angelegten Screenings konnten keine homolog rekombinanten ES-Zellklone identifiz iert werden. Das Fgd1 Gen ist auf dem X-Chromosom lokalisiert und seine Null Mutation bewirkt bereits ein funktionelles Knock out in R1 ES Zellen, die aus einem männlichen Embryo gewonnen wurden. Das erfolglose konstitutive Targeting deutet an, dass Fgd1 möglicherweise eine Bedeutung in embryonalen Stammzellen und in der Präimplantationsentwicklung hat. Diese Hypothese wurde durch den Nachweis einer Fgd1 Expression in embryonalen Stammzellen und in frühen Stadien der „Embryoid bodies“ bestätigt. Um den wahrscheinlich negativen Effekt der Fgd1-Defiz ienz in konstitutiv getargeteten ES-Zellen zu umgehen, wurde eine konditionale Targetingstrategie angewandt. ES Zellen mit einem gefloxten Fgd1-Gen, die somit für die Herstellung einer transgenen Maus verwendet werden können, wurden hergestellt.



Das Expressionsprofil von Fgd1 in Sehnen und Bändern lässt vermuten, dass die Schwanenhalsdeformität, welche ein primäres Kriterium des AAS darstellt, durch eine Operation der Bänder behandelt werden kann. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Littler Tenodese, ein
gebräuchlicher operativer Eingriff zur Behandlung der Schwanenhalsdeformität in rheumatoider Artrithis, auch für die Behandlung des Ligamentum reticulare obliquum in der mit dem AAS assoziierten Schwanenhalsdeformität verwendet werden kann. Ein 28-jähriger AASPatient wurde mit dieser Methode behandelt und postoperativ intensiv begleitet. Durch die Beobachtung der Sensibil ität, der Gelenksbewegung und der Greifstärke wurde die vollständige Erholung aller Parameter gezeigt.