Mitochondrial DNA (mtDNA) is organized in nucleoids, structures comprising an association of multiple DNA molecules and proteins with various functions. Its vicinity to the electron transport chain, the main production site of superoxide, makes it highly vulnerable to oxidative damage. Recent findings by our group have revealed the presence of the major superoxide-detoxifying enzyme Manganese Superoxide Dismutase (MnSOD) within the nucleoid structure of tissues from different species and of several cell lines. The binding of MnSOD to DNA was shown to be direct and salt-sensitive, suggesting the implication of ionic forces.
This led to the investigation in the present work of the nature of this binding and the possible involvement of positively charged lysine residues of the enzyme with the negatively charged backbone of the mtDNA. After mutation of three specific lysines of human MnSOD by sitedirected mutagenesis, expression in E. coli and purification, binding of MnSOD mutants to oligonucleotides was measured by a Surface Plasmon Resonance based method. Wild-type and mutant MnSODs all exhibited an association with DNA, suggesting that the binding does not rely on these specific lysines or at least not exclusively.
The isolation of nucleoids on sucrose density gradients revealed the lack of an association of MnSOD to mtDNA in the Hela cell line and in the Parkinson model cell line LUHMES. MnSOD was present in nucleoids of Xenopus laevis oocytes of stages 1 and 6 while absent in oocytes of stage 3.
An Fpg-based version of the automated Fluorimetric Analysis of DNA Unwinding assay for the detection of 8-oxo-,8-dihydroguanine (8-oxodG) was developed by our group. The method was validated by the concurrent detection of 8-oxodG levels in the same plasmid DNA samples by HPLC coupled with LC/MS which displayed a high correlation in the values measured. The method allowed the detection of 8-oxodG formation induced by the peroxynitrite donor 3-Morpholinosyndnomine (Sin-1) in a dose-dependent manner which was prevented by addition of MnSOD, as well as uric acid and minocycline.
The damaging effects of peroxynitrite on mitochondrial biomolecules were further investigated by the detection of tyrosine nitration of mitochondrial proteins in peroxynitritetreated human platelets by Western Blot. Peroxynitrite induced tyrosine nitration of recombinant human MnSOD which led to its inactivation. RAW264.7 macrophage cells treated with Sin-1 exhibited increased 8-nitroguanine levels detected by immunofluorescence
and increased mitochondrial 8-oxodG levels measured by HPLC LC/MS.

Die mitochondriale DNA (mtDNA) besteht aus Nukleotiden, dabei handelt es sich um Strukturen, die aus einer Assoziation von multiplen DNA Molekülen und Proteinen unterschiedlicher Funktion zusammengesetzt sind. Ihre Nähe zu der Atmungskette, der Hauptproduktionsstätte von Superoxid, macht sie für oxidative Schäden besonders anfällig. Nach neuesten Erkenntnissen unserer Arbeitsgruppe ist das Superoxid-detoxifizierende Enzym Mangan Superoxid Dismutase (MnSOD) innerhalb der nukleoiden Struktur von Geweben verschiedener Spezies und Zelllinien nachweisbar. Es konnte gezeigt werden, dass das Zusammenwirken von MnSOD mit der DNA zu einer gesteigerten Empfindlichkeit gegenüber hohen Salzkonzentrationen führt, was auf die Implikation von ionischen Kräften hindeutet.
Aus diesem Grund war es Ziel dieser Arbeit die Ursache dieses Zusammenwirkens, speziell im Hinblick auf eine mögliche Beteiligung von positiv geladenen Lysin-Resten des Enzyms an dem negativ geladenen Rückgrat der DNA zu untersuchen. Nach Mutation von drei bestimmten Lysinresten in der humanen MnSOD durch gezielte Mutagenese, anschließender Expression in E. coli und Purifikation wurde die Interaktion von MnSOD Mutanten mit Oligonukleotiden durch eine Oberflächenplasmonenresonanz-Messung (engl.: surface plasmon resonance, SPR) durchgeführt. Sowohl Wildtyp und als auch Mutanten MnSODs wiesen eine Assoziation mit der DNA auf. Dies legt nahe, dass die Verbindung nicht von diesen spezifischen Lysinen abhängt oder zumindest nicht ausschließlich.
Die Isolation von Nukleoiden mittels eines Saccharose Dichtegradienten zeigen, dass keine Assoziation von MnSOD mit der mtDNA in der Hela Zelllinie und der Parkinson Modell Zelllinie LUHMES vorliegt. MnSOD war in Nukleoiden von Xenopus laevis Oozyten im Stadium 1 und 6 vorhanden, jedoch nicht in den Oozyten des Stadium 3.
Für den Nachweis von 8-oxo-,8-Dihydroguanin (8-oxodG) wurde von unserer Arbeitsgruppe eine modifizierte Version der automatisierten fluorimetrischen Analyse des DNA Unwinding Assays entwickelt. Diese Methode wurde zusätzlich durch die Messung des 8-oxodG Gehalts in den gleichen Plasmid DNA Proben mittels HPLC kombiniert mit LC/MS validiert. Die durch beide Methoden gemessenen Werte wiesen eine hohe Korrelation auf. Es konnte einekonzentrationsabhängige 8-oxodG Bildung als Folge einer Peroxynitrit generierende 3-Morpholinosyndnomine (Sin-1) Behandlung nachgewiesen werden. Zugabe von MnSOD, Harnsäure und Minozyklin hat die Bildung dieser 8-oxodG Läsionen verhindert.
Des Weiteren wurde die schädigende Auswirkung von Peroxynit auf mitochondriale Biomoleküle untersucht. Dafür wurden humanen Thrombozyten mit Peroxynitrit exponiert, um anschließend Tyrosin Nitrierungen mitochondrialer Proteine mittels Western Blot zu detektieren. Die Nitrierung von MnSOD durch diese Exposition führte zur Inaktivierung des Enzyms. Mit Sin-1 behandelte RAW264.7 Makrophagen wiesen eine erhöhte 8-Nitroguanin Konzentration auf, welches zum einen mittels Immunofluoreszens als auch durch einen
erhöhten mitochondriale 8-oxodG Level (HPLCLC/MS) gezeigt werden konnte.