Biochemische Charakterisierung von DEK
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Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurden die Bindungseigenschaften von DEK an proteinfreie DNA und Chromatin untersucht. Es stellte sich heraus, dass DEK die Topologie von beiden Substraten derart verändert, dass fixierte, positive Supercoils eingeführt werden. Für die proteinfreie DNA konnte dies direkt, für Minichromosomen indirekt gezeigt werden. Die Bindung von DEK erfolgt sequenzunspezifisch, womit die Arbeiten von Fu et al. und Faulkner et al. (Fu et al. 1997; Faulkner et al. 2001) im Hinblick auf die Sequenzspezifität widerlegt werden konnten, während die Arbeit von Alexiadis et al. bestätigt wurde (Alexiadis et al. 2000). DEK bindet vielmehr strukturspezifisch an DNA, so konnte gezeigt werden, dass DEK bevorzugt an Kruziform-DNA bindet. Darüber hinaus brachte die Arbeit Hinweise darauf, dass DEK auch präferenziell an supergecoilte DNA bindet.
Des Weiteren wurden ausführliche Studien über die Strukturveränderungen, die durch DEK, sowohl an proteinfreier DNA als auch an Minichromosomen, induziert werden, durchgeführt. Hierbei stellte sich heraus, dass DEK Minichromosomen sehr stark kompaktiert, indem es intramolekulare Wechselwirkungen hervorruft, während DEK mit proteinfreier DNA große DNA-Protein-Komplexe aus mehreren DNA-Molekülen bildet.
Es gibt erste Hinweise, dass die Bindung von DEK von einem unbekannten Faktor im Drosophilaembryoextrakt reguliert werden könnte, denn in Anwesenheit von DEK wird das Chromatin zwar unzugänglicher für Mikrokokkennuklease, aber die regelmäßige Positionierung der Nukleosomen bleibt erhalten.
Im dritten Abschnitt dieser Arbeit sind Versuche beschrieben, die den Einfluss von DEK auf das Chromatinremodeling analysieren. DEK stimuliert die Aktivität des Remodelingfaktors Acf1/ISWI im Nukleosomen- Sliding -Assay auch in Abwesenheit von ATP. Dieses Ergebnis könnte ein Schlüssel für die Mechanismen sein, mit denen die Remodelingfaktoren Nukleosomen auf einem DNA-Fragment verschieben.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
We have investigated the molecular mechanism by which the proto-oncogene protein DEK, an abundant chromatin-associated protein, changes the topology of DNA in chromatin in vitro. We report here that the DEK protein introduces constrained positive supercoils both into protein-free DNA and into DNA in chromatin. This involves a change in linking number that is reversible after removal of the DEK protein. As shown by sedimentation analysis and electron microscopy, the DEK-induced positive supercoiling causes distinct structural changes of DNA and chromatin. The observed direct effects of DEK on chromatin folding help to understand the function that this major chromatin protein performs in the nucleus.
The sequence and structure specificities of DEK/DNA interactions are not completely understood. We found that DEK binding to DNA is not sequence specific, but determined a clear preference for supercoiled and four-way junction DNA. In the presence of topoisomerase II, DEK stimulates intermolecular catenation of circular DNA molecules. DEK also increases the probability of intermolecular ligation of linear DNA molecules in the presence of DNA ligase. These binding properties suggest that DEK belongs to the group of architectural proteins.
Moreover we have shown that DEK stimulates the nucleosome sliding activity of the remodeling factor Acf1/ISWI even in absence of ATP. These results could be a hind for the mechanism with which the sliding of nucleosome occurs.
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WALDMANN, Tanja, 2003. Biochemische Charakterisierung von DEK [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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