The natural compounds Aristolochic Acid (AA), Ochratoxin A (OTA) and Cycasin are nephrotoxic and carcinogenic in rodents. AA and OTA exposure in humans are known and human exposure to Cycasin is suspected. Despite exposure, toxic effects in humans are only proven for AA. However, the observed effects of the genotoxic substance AA in humans were different to those seen in rodents, suggesting a species-specific mechanism of action. In vitro-models could serve as a powerful tool to evaluate species-specific toxicity. Especially the use of human primary cells could enable characterisation and evaluation of possible human-specific effects.
It was postulated, that in vitro-systems, in addition to in vivo-Studies, are a valuable tool to investigate species-specific toxicity of AA, OTA and Cycasin. The aim of the study was to examine the susceptibility of different kidney cortex cell models (continuous cell lines, primary cells) to the toxin in question and therefore their value for studying species-specific effects.
In this study, the cytotoxicity of AA, OTA and MAMAc was evaluated and used for a pre-selection of cells (cell line, primary cells) sufficiently susceptible to the toxin in question. Furthermore, effects of the genotoxic compounds AA and MAMAc on the cell cycle and the induction of DNA-strand breaks and DNA-repair were examined. Finally, the effects of AA and OTA on gene-expression were studied.
Cytotoxic response was generally higher in primary cells as in the corresponding cells lines, possibly reflecting the higher status of differentiation in primary cells. The observed reduction of cell proliferation and the observed induction of cdkn1a-gene-expression indicate a genotoxic effect of AA in vitro, which seems to reflect sufficient susceptibility of the used cell model. In contrast to this, AA and OTA had only a small effect on gene-expression. However, the low degree of deregulation as well as the small number of deregulated genes could be a result of the low toxin concentrations used. Nevertheless, deregulation of toxin-relevant genes was observed. In this study, species-specific differences in cytotoxicity of AA and MAMAc were shown, with toxicity being highest in kidney cortex cells of porcine origin. These results are in accordance with prior results, showing metabolic activation of AA to be species-dependent, with minipigs having the most effective activation system followed by human and rat. Although cytotoxicity assays can not allow discrimination of distinctive mechanistic responses, it is suspected that the description of constitutive differences in the susceptibility of cells originating of different species can be achieved.
From this study, primary kidney cortex cells appear to be a valuable tool to investigate the toxicity of AA, OTA and Cycasin. Furthermore, human primary cells seem to be useful for the evaluation of possible human-specific effects. However, the availability and quality of biopsy material from primary care facilities for the establishment of primary human cell culture is highly variable and commercially available cells are expensive. Given the genetic proximity of human and pigs and the anatomical and physiological similarity of the kidneys, future direction should therefore consider the use of primary porcine cell models as an alternative system.

Aristolochia Säure (AA), Ochratoxin A (OTA) und Cycasin sind toxische und kanzerogene Naturstoffe. Eine nierentoxische und nierenkanzerogene Wirkung der Substanzen wurde in Nagetieren festgestellt. Eine Exposition des Menschen gegenüber den Substanzen AA und OTA wurde nachgewiesen und eine humane Exposition gegenüber dem Pflanzenextrakt Cycasin wird vermutet. Trotz der Exposition ergaben sich bisher nur für AA eindeutige Hinweise auf nierentoxische und nierenkanzerogene Effekte im Menschen. Diese unterscheiden sich jedoch von den Effekten, die in Nagetieren beobachtet wurden. Es stellt sich die Frage, ob die beobachteten Unterschiede der durch AA-induzierten Effekte, bzw. die anscheinend fehlende Sensitivität des Menschen gegenüber OTA und Cycasin, auf spezies-spezifische Toxizitätsunterschiede zurückzuführen sind.
Durch den Einsatz von in vitro-Modellen kann humanes Probenmaterial zur Untersuchung potentieller human-spezifischer Effekte von toxischen Substanzen verwendet werden. In der vorliegenden Studie sollte die Hypothese überprüft werden, dass ausgewählte in vitro-Modelle, in Ergänzung zu in vivo-Studien, zur Aufklärung der Toxizität und der Wirkungsmechanismen der Substanzen AA, OTA und Cycasin und damit zur Ermittlung spezies-spezifischer Toxizitätsunterschiede beitragen können. Das Ziel dieser Studie war es, verschiedene in vitro-Systeme des Nierenkortex (Zelllinie, primäre Zellen) hinsichtlich ihrer Eignung als Zellmodelle für die oben genannte Fragestellung zu untersuchen. Ein besonderes Augenmerk galt der Möglichkeit, primäre Schweinenierenkortexzellen als Surrogat für humane Zellen einsetzen zu können.
Die Sensitivität der in vitro-Modelle (Zelllinien, primäre Zellen) gegenüber den Toxinen wurde mittels Zelltoxizitätsassays ermittelt und eine Präselektion ausreichend sensitiver Zellmodelle durchgeführt. Des Weiteren wurden die Effekte der Genotoxine AA und MAMAc auf den Zellzyklus und die Induktion von DNA-Strangbrüchen und DNA-Reparatur durch AA untersucht. Eine Analyse der Genexpression nach AA- und OTA-Exposition wurde durchgeführt und die Resultate mit in vivo-Studien verglichen. Um erste Hinweise auf spezies-spezifische Toxizitätsunterschiede zu erhalten, wurde die Zytotoxizität der Substanzen AA und MAMAc gegenüber primären Nierenkortexzellen der Spezies Ratte, Mensch und Schwein untersucht.
Die Sensitivität primärer Nierenkortexzellen war generell im Vergleich zur entsprechenden Zelllinie größer oder vergleichbar. Es ist zu vermuten, dass die jeweils größere Sensitivität auf den Differenzierungsgrad zurückzuführen ist, der in primären Zellen generell höher ist. Entsprechend der Erwartung lassen die Ergebnisse, die eine AA-induzierte Zellproliferationsreduktion und eine Expressionsinduktion des Zellzyklus-spezifischen Gens cdkn1a zeigen, eine im in vitro-Modell induzierte DNA-Schadensantwort erkennen. Dies lässt auf eine, für weitere mechanistische Untersuchungen notwendige, Sensitivität des renalen Zellmodells gegenüber dem Nephrotoxin AA schließen. Das geringe Ausmaß der AA- und OTA-induzierten Genexpressionsderegulation und die geringe Anzahl deregulierte Gene erscheinen durch die relativ niedrigen Toxinkonzentrationen bedingt zu sein. Eine Deregulation Toxin-relevanter Gene ist jedoch zu beobachten. Die in vitro-Studie ergibt erste Hinweise auf spezies-spezifische Unterschiede der Toxine AA und MAM-Acetat. So zeigt der Vergleich der Zytotoxizität der Substanzen, dass die Toxizität in Schweinenierenkortexzellen generell am höchsten ist. Diese Beobachtung stimmt mit Ergebnissen überein, die zeigen, dass die Metabolisierung des Toxins AA zu toxischen Derivaten in Schweinenierenkortexzell-Fraktionen am höchsten ist. Des Weiteren zeigt sich, dass Rattennierenkortexzellen im Vergleich zu humanen Nierenkortexzellen sensitiver sind.
Die vorliegende Studie deutet darauf hin, dass in vitro-Modelle, insbesondere primäre Zellkulturen, für mechanistische Untersuchungen der Toxizität von AA, OTA und Cycasin genutzt werden können. Die Möglichkeit, menschliche Zellen einsetzen zu können, erlaubt zudem die Erforschung spezies-spezifischer Toxizitätsunterschiede der Substanzen. Die geringe Verfügbarkeit humaner Zellen, deren heterogene Qualität und die Kosten des Erwerbs primärer Zellen kann in vitro-Studien jedoch beeinträchtigen. Aufgrund der genetischen Vergleichbarkeit der Spezies Schwein und Mensch, sowie der anatomischen und physiologischen Ähnlichkeit der Nieren, könnten in zukünftigen Studien die Verwendung von primären Schweinenierenkortexzellen als mögliches Surrogat in Erwägung gezogen werden.