Kinetic studies on different DNA polymerases using 4'-alkylated 2'-deoxynucleotide probes
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Verschiedene kinetische Studien zur Selektivität von DNA-Polymerasen werden vorgestellt. Zuerst werden 4'-alkylierte Thymidin- und 2'-Desoxyadenosintriphosphate als sterische Sonden vorgestellt, um die Rigidität des Aktiven Zentrums von DNA-Polymerasen in Aktion zu untersuchen. Desweiteren wird die Synthese von chemisch modifizierten DNA-Templaten vorgestellt, welche in kinetischen Studien die Untersuchung des Aktiven Zentrums gegenüber der Nukleotideinbaustelle ermöglichen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die chemisch modifizierten Nukleosidtriphosphate und Templatstränge in Michaelis-Menten Steady-state Kinetiken an zwei DNA-Polymerasen, KF exo- und Dpo4, verwendet. In einem dritten Projekt wurden die modifizierten Triphosphate in Presteady-State Kinetiken am Wildtyp-Enzym der Klentaq DNA-Polymerase eingesetzt. Die Ergebnisse dieser kinetischen Studien sowie weiterer struktureller Daten führten durch ortsgerichtete Mutagenese zu einer DNA-Polymerasen Mutante mit erhöhter Akzeptanz für 4'-alkylierte Substrate. Presteady-state Kinetiken dieser Mutante und einer weiteren DNA-Polymerasen Mutante zeigten die Beteiligung einer Aminosäure am Zuckererkennungsprozess von Nukleotiden.
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Different kinetic studies on selectivity of DNA Polymerases are presented. First 4'-alkylated modified thymidine and 2'-deoxyadenosine triphosphates are introduced as steric probes to allow evaluating the rigidity of the active site of DNA Polymerases dynamically. Furthermore chemically modified DNA template strands are synthesized to enable kinetic studies probing DNA polymerases active site opposite nucleotide incorporation site. In a second part of this thesis the chemically modified nucleoside triphosphates and template strands are used in Michaelis-Menten steady-state kinetic studies on two different DNA polymerases, KF exo- and Dpo4. In a third project the modified nucleoside triphosphates are applied in presteady-state kinetic studies on Klentaq DNA polymerase wild-type. From these kinetic data and further structural data a DNA polymerase mutant with increased acceptance for 4'-alkylated substrates could be obtained by site-directed mutagenesis. Through presteady-state kinetics on this mutant and on another DNA polymerase mutant the participation of a single amino acid in the sugar recognition of nucleotides could be identified.
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ISO 690
STRECKENBACH, Frank, 2010. Kinetic studies on different DNA polymerases using 4'-alkylated 2'-deoxynucleotide probes [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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