Die Internalisierung und der intrazelluläre Transport von GPCRs ist ein hoch regulierter und dynamischer Prozess, der für Desensibilisierung, Phosphorylierung und Resensibilisierung vieler GPCR entscheidend ist. Viele GPCRs erreichen durch die durch Rab5 gesteuerte Internalisierung ein starkes Signal, da sie den Rezeptor und seine Effektoren in die Nähe der nächsten Komponenten der Signalkaskade bringen. Normalerweise wird das Signal dadurch beendet, dass der Rezeptor zu multivesikulären Körperchen gebracht wird. Das schnelle Recyclen durch Rab4 erlaubt mehrere Zyklen von kürzerer GPCR Aktivierung und starke Signale an der Membran. Im Gegensatz dazu führt das langsamere Rezeptorrecycling durch Rab11 zu einem Signal, das tiefer in das Zytoplasma reicht. Lange Zeit wurde die Funktion von Rab Proteinen, Vesikel von einer zur anderen Membran zu transferieren, als eher passiv angesehen. Unsere Ergebnisse zeigen nun, dass Rezeptoren der Frizzled Familie in vitro direkt mit Rab5 interagieren können und diese GTPase in Drosophila Zellen aktivieren können. Außerdem konnten wir zeigen, dass der Prozess der Frizzled Internalisierung von Gαo abhängig ist. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Gαo in vitro direkt an Rab5 und Rab4 bindet und dass es Rab5 durch Rekrutierung des Proteins an die Membran aktiviert. Dies ist der erste Beweis einer direkten und funktionellen Interaktion eines Gαo-Proteins mit einer Rab-GTPase. Wir zeigen das Mitwirken von Rab4, Rab5 und Rab11 in der planaren Zellpolarität und im Wingless-Frizzled Signaltransduktionsweg in Drosophila und schlagen ein Model für die Regulierung beider Signalwege vor. Wir schlagen vor, dass die durch Frizzled hervorgerufenen Aktivierung von Gαo zur Rekrutierung von Rab5 in die Nähe der Frizzeld-Rezeptoren führt, wodurch die Endozytose des Rezeptors katalysiert und daher die Signalintensität amplifiziert wird. Danach definieren unterschiedliche Transportwege der Frizzled Komplexe die Spezifität der Aktivierung von Wingless oder planaren Zellpolarität Frizzled-Signalwege. Unsere Beobachtungen bringen Erkenntnisse für den Frizzled- Signaltransduktionsweg und seine Regulierung, ebenso wie für die gesamte GPCR-Biologie.
Zusätzlich haben wir einen in vitro Assay etabliert, um G-Proteine untersuchen zu können und wir konnten zeigen, dass Europium-GTP in den gleichen Experimenten, in denen traditionell radioaktive Nukleotide eingesetzt werden, verwendet werden kann. Daher vermeidet dieser Assay nicht nur die Nachteile von radioaktiven GTPγS, die mit der Verwendung von radioaktiven Komponenten und radioaktivem Abfall einhergehen und daher in der modernen Laborpraxis unerwünscht sind, sondern ermöglicht auch Experimente im "high-throughput" Format durchzuführen. Unsere Methode verwendet die zeitauflösende Fluorometrie, eine etablierte Technologie, die die fluoreszierenden Eigenschafen von Lanthanoidchelaten verwendet, als leistungsfähige Alternative für Assays mit radioaktiven Isotopen

The internalization and intracellular trafficking of GPCRs is a highly regulated and dynamic process. It is important for the desensitization, dephosphorylation and resensitization of many GPCRs. For many GPCRs, Rab5 guided internalization is the way to achieve strong signaling by bringing the receptor and its effectors to the vicinity of the next components of the cascade. On the other hand, bringing of the GPCRs to the multivesicular bodies is the common way to shut down the signal. Fast recycling through Rab4 can allow many cycles of GPCR activation for shorter time and so strong signaling at the membrane. In contrast slow recycling of receptors through Rab11 allows signaling deeper in the cytoplasm. For a long time the function of the Rab proteins was considered to be quite passive - transferring vesicles from one membrane to another. Our present results show that receptors of the Frizzled family directly interact with Rab5 in vitro and can activate this GTPase in Drosophila cells. We also show that the process of Frizzled internalization is Gαo dependant. Moreover we demonstrate that Gαo directly binds Rab5 and Rab4 in vitro and activates Rab5 in vivo through membrane recruitment. This is the first demonstration of a direct and functional interaction of a Gα-protein with Rab GTPases. We demonstrate the involvement of Rab4, Rab5 and Rab11 in the planar cell polarity and Wingless-Frizzled signaling in Drosophila and we propose a model for regulation of the both pathways. We propose that Frizzled-mediated activation of Gαo leads to recruitment of Rab5 to the vicinity of the Frizzled receptors, catalyzing receptor endocytosis and thus amplifying the signal transduction intensity. Later, different trafficking routes of Frizzled complexes determine the specificity of activation of the Wg vs the PCP branches of Frizzled signaling. So that Gαo and Rabs act like a pointsmans in these trafficking routes. Our observations bring important knowledge about Frizzled signaling and regulation, as well as for the GPCR biology in general.
Additionally, we have established an in vitro assay for studying the G proteins and showed that Europium-GTP can be used in the same type of experiments as those traditionally utilizing radioactive nucleotides. This assay not only omits the disadvantage of the radioactive GTPγS connected with handling of radioactive compounds and waste, which are undesirable in the modern laboratory practice but it also allows experiments to be done in a high-throughput format. Our method utilizes the precise time-resolved fluorometry which is a well-established technology that exploits the unique fluorescence properties of lanthanide chelates to provide a powerful alternative to radioisotopic assays