Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die dritthäufigste tumorassoziierte Todesursache. Man sucht nachwievor nach einer effektiveren zielgerichteten regionalen Krebsbehandlung innerhalb der Leber. TNF war das erste Zytokin das für die Krebstherapie angewendet wurde. Eine systemische Anwendung von TNF ist nicht möglich, da die benötigte antitumorale Dosis die maximal tolerierte Dosis übersteigt. Die in situ isoliert perfundierte Leber ermöglicht die Applikation von TNF ohne systemische Toxizität, jedoch mit Schädigung gesunden Lebergewebes. Im Gegensatz zum klassischen Ansatz des selektiven Tumor-Treffers verfolgt diese Arbeit die Alternative des selektiven Schutzes der gesunden Zellen vor TNF-induzierter Apoptose. Fruktose-induzierte ATP Depletion, die auf den leberspezifischen Fruktosestoffwechsel zurückzuführen ist, verhindert TNF- induzierten Zelltod. Es wurde zunächst der Fruktose-induzierte zytoprotektive Mechanismus und Veränderungen im Energiemetabolismus untersucht. Die verwendeten Hepatomzelllinien wiesen keine durch Fruktose hervorgerufene ATP Depletion und den damit verbundenen Schutz gegenüber TNF auf, während primäre Hepatozyten der Maus, Ratte und des Menschen durch Fruktose-induzierte ATP Depletion geschützt waren. Veränderungen der spezifischen Aktivität der am leberspezifischen Fruktosestoffwechsel beteiligten Enzyme Fruktokinase und Aldolase B konnten das Ausbleiben der ATP Depletion in den Zelllinien nicht erklären. Die Aktivität der low-Km Hexokinasen war in allen Zelllinien im Gegensatz zu den entsprechenden Primärzellen erhöht, und eine verstärkte Expression der Hexokinase Isoform II (HKII) auf mRNA- und Proteinebene wurde nachgewiesen. Pharmakologische Inhibition der Hexokinasen durch 3-Brompyruvat ermöglichte fruktoseinduzierte ATP Depletion in HepG2-Zellen. Auf der anderen Seite wurde Fruktose-vermittelte ATP Depletion durch HIF1-induzierte Hochregulation der HKII in primären murinen Hepatozyten verhindert. Entsprechend konnte die Protektion der primären murinen Hepatozyten mittels Fruktose gegenüber TNF-induzierter Apoptose durch Überexpression der HKII aufgehoben werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die erhöhte Expression der HKII in transformierten Zellen hepatischen Ursprungs zu einem Übergang vom leberspezifischen zu einem muskelspezifischen Fruktosemetabolismus führt, wodurch Fruktose-vermittelte ATP Depletion und der daraus resultierende Zellschutz vor TNF-induzierter Apoptose verhindert wird. Daraus folgt, dass die Hochregulation der HKII in malignen Zellen hepatozellulären Ursprunges eine Voraussetzung darstellt, um selektiv diese Zellen durch TNF in Anwesenheit von Fruktose zu attackieren und gleichzeitig selektiv gesunde Hepatozyten zu schützen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der molekulare Mechanismus untersucht, welcher durch ATP Depletion diesen Schutz verursacht. Fruktose-induzierte ATP Depletion führte zu transienter extrazellulärer Akkumulierung des ATP Abbauproduktes Adenosin in vitro und in vivo. Adenosin induzierte in einem autokrinen Mechanismus die Produktion des second Messenger cAMP. Adenosin und cAMP führten in Analogie zu Fruktose zu inversen Effekten auf CD95- und TNF-induzierte Apoptose. Beide Effekte waren sensitiv gegenüber Inhibitoren der PKA. Die Analyse des TNF- induzierten MAP-Kinase Signalweges zeigte auf, dass ATP Depletion mittels Fruktose, sowie cAMP die proapoptotische, verlängerte Phase der TNF- induzierten JNK Aktivierung inhibieren. Dies könnte die konträren Effekte von Fruktose auf CD95- und TNF-induzierte Apoptose erklären, da JNK nur im TNF-vermittelten Zelltod essentiell ist. Inhibition des proapoptotischen JNK Signalweges durch Fruktose verhinderte die Aktivierung des mitochondrialen Verstärkungsmechanismus durch Bid, da sowohl die Spaltung von Bid, als auch die Translokation von tBid zum Mitochondrium unter Mitwirkung der PKA gehemmt wurde. Basierend auf diesen Daten postulieren wir, dass ATP Depletion durch Fruktose die TNF- und CD95-induzierte Apoptose über einen Adenosin-/cAMP-/PKA-vermittelten Prozess moduliert. Des Weiteren hemmt PKA die TNF-induzierte verlängerte und proapoptotische JNK Aktivierung, die als essentiell für TNF-vermittelte Apoptose beschrieben wurde. Diese Daten erklären das mechanistische Prinzip der Modulation der zytokininduzierten Apoptose in Hepatozyten durch Fruktose. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit auf, dass maligne Hepatozyten ihren leberspezifischen Fruktosestoffwechsel durch tumorspezifische Veränderungen im Energiemetabolismus verlieren. Dies bedingt, dass diese Zellen nicht durch Fruktose vor TNF-induzierter Apoptose geschützt werden, da der zytoprotektive Effekt direkt auf dem Fruktosestoffwechsel basiert. Der Schutzmechanismus vor TNF-induziertem Zelltod wurde aufgeklärt. Die Befunde führen zu einem neuen Konzept der Machbarkeit selektiver Tumortherapie innerhalb der Leber, indem in malignen Hepatozyten Apoptose induziert wird, während die gesunden Leberzellen geschützt werden.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third most common tumor-associated cause of death. The lack of curative therapy for HCC highlights the need for more effective liver-directed regional cancer therapies. TNF was the first cytokine used for cancer treatment but first clinical trials showed that the effective TNF dose needed to exceed the maximum tolerated dose, thereby preventing the systemic use. Isolated hepatic perfusion enabled the application by preventing systemic toxicity, but even in this regional use selectivity for malignant cells is an unsolved problem. Tolerance of the healthy tissue to anticancer agents such as TNF represents the dose-limiting factor in isolated hepatic perfusion. Introduction of selectivity into TNF-based cancer cell killing by selective protection of healthy tissue would make the killer molecule TNF tumor-specific. Fructose-induced hepatic ATP depletion, which is due to the liver- specific fructose metabolism, was shown to prevent TNF-induced cell death. In the first part of this thesis, the cytoprotective potential of fructose and the alterations in the energy metabolism were characterized. All tested hepatoma cell lines lacked fructose-induced ATP depletion and protection against TNF-induced cell death, while primary mouse, rat and human hepatocytes showed ATP depletion and protection. Alterations in the specific activity of fructokinase and aldolase B catalysing the liver-specific metabolism were not responsible for the lack of ATP depletion in the cell lines. Activity of low-Km hexokinases was increased in all cell lines compared to primary hepatocytes and an upregulation of hexokinase isoform II was detected on the level of mRNA and protein. Pharmacological inhibition of hexokinases by 3-bromopyruvate restored fructose-induced ATP depletion in HepG2 cells. In contrast, increased expression of HKII via stabilisation of the transcription factor HIF1 prevented fructose-induced ATP depletion in primarymurine hepatocytes. Fructose-mediated cytoprotection of primary murine hepatocytes against TNF-induced apoptosis was prevented by overexpression of HKII. These findings show that increased expression of HKII in transformed cells of hepatic origin leads to a shift from liver-type to muscle-type fructose metabolism, thereby preventing fructose-induced ATP depletion and protection against TNF-induced apoptosis. Increased expression of HKII is a typical hallmark of rapidly growing tumors such as HCC and plays a central role in the Warburg effect. Based on the obtained data we propose to take advantage of the increased expression of HKII in liver tumors for transiently protecting healthy liver cells. Since cytoprotection of fructose-induced ATP depletion against TNF-induced hepatocyte apoptosis is the crucial point, the second part of the thesis addressed the molecular mechanism(s) mediating this protection downstream of ATP depletion. Fructose-induced ATP depletion resulted in transient extracellular accumulation of the ATP degradation product adenosine in vitro and in vivo. Adenosine induced a cAMP response in an autocrine manner. cAMP and adenosine mimicked the inverse effects of fructose on CD95- and TNF- induced apoptosis. Both effects were sensitive to inhibition of PKA. Analysis of TNF-induced MAP kinase signalling revealed that fructose-mediated ATP depletion as well as cAMP signalling prevented the proapoptotic, sustained phase of TNF-induced JNK activation. This may explain the dichotomous effects of fructose on apoptosis induced by TNF or CD95, since JNK is only essential for TNF-induced apoptosis. Fructose-mediated inhibition of prolonged JNK signalling prevented activation of the intrinsic mitochondrial amplification loop by Bid, since Bid cleavage as well as tBid translocation to mitochondria was prevented in a PKA-dependent manner. Based on these data we propose fructose-induced ATP depletion to modulate TNF- and CD95- induced apoptosis in an adenosine/cAMP/PKA-mediated process. PKA inhibits TNF-induced prolonged JNK activation, thereby preventing Bid cleavage, which is essential for TNF-induced apoptosis. These findings provide a mechanistic rationale for the modulation of cytokine-induced hepatocyte apoptosis by fructose.
In summary, this thesis contributes to the understanding how tumor-specific alterations in the energy metabolism of malignant cells of hepatic origin circumvent liver-specific fructose metabolism. As a consequence, these cells loose the mechanism of fructose-mediated protection from TNF-induced apoptosis, since it is based on the liver-specific fructose metabolism. Additionally, the presented data elucidate the molecular mechanism of TNF-induced apoptosis prevention by fructose. As a pragmatic corollary from these findings, a new concept of selective tumor therapy in the liver is proposed, which exploits selective induction of apoptosis in malignant hepatic cells combined with specific transient protection of healthy liver cells.