In the first part of the available thesis the DNA-binding of the human ORC complex was characterized more exactly by in vitro studies. The following ORC complexes could be expressed and up-cleaned by the Baculovirus system: ORC2-5, ORC1-5 and ORC1-5/Cdc6. The binding activity of these complexes was analyzed in gel-shift-experiments and target-bound-assays with the UPR-fragment from the MCM4-promotor region and a pUPR-plasmid, which contains also the UPR-region. It was stated that, differently than in low eukaryotes such as Saccharomyces cerevisiae, the human ORC proteins bind nonspecific to DNA, whereby a preference for AT-rich sequences could be identified. In addition could be shown that the ORC1-5- and ORC1-5/Cdc6-complex obtained one, probably by Orc1 and Cdc6, stronger DNA connection exhibits than the ORC2-5-complex. Divide this result agree with observations in Xenopus laevis.
In the following parts of the work through in vivo studies the human replication protein Cdc6 was characterized during the cell cycle and the function was examined by the cell-free in vitro replication-system.
It was found that Cdc6 is synthesized to the same quantities during the cell cycle. This information increases the growing realizations over the expression of Cdc6 in mammalian cells. The sequential and continuous synthesis of Cdc6 is surprising in S-phase. The subcellular distribution of Cdc6 during the cell cycle is steered mainly by phosphorylation, phosphorylated Cdc6 becomes detached in S phase and is transported to the cytoplasm. Despite S phase mediated core-cytoplasm-transfer some Cdc6 still remains chromatin-bound. A reason for this could be the high quantity forming of Cdc6 during S phase.
In addition in this section it was shown that the quantities of marked chromatin-bound Cdc6 are similar in G1 and S phase. These results prove that Cdc6 dissociates during S phase of the chromatin, is transferred to the cytoplasm and is then replaced by newly synthesized Cdc6. Once bound to chromatin, the again marked Cdc6 behaves like the old one; it dissociates and disappears from the chromatin with a radioactive half-life of < 4h. This cycle of synthesis, chromatin binding and dissociation must be connected with functions of Cdc6 in the genome-replication. One function is surely the assembly of the pre-replication-complex, but still further functions must be necessary for the initiation of the DNA-replication or the time after, e.g. the activation of late origins.

The data of this work inform additionally to already existing results about components and structure of the pre-replication-complexes and can therefore be used as basis for developing studies.

In der vorliegenden Dissertation wurden im ersten Teil durch in vitro Studien die DNA-Bindungseigenschaften des menschlichen ORC-Komplexes genauer charakterisiert. Durch das Baculovirus-System konnten folgende ORC-Komplexe exprimiert und aufgereinigt werden: ORC2-5, ORC1-5 und ORC1-5/Cdc6. Die Bindungseigenschaften dieser Komplexe wurden in Gel-Shift-Experimenten und Target-Bound-Assays mit dem UPR-Fragment aus dem MCM4 Genpromotor Bereich und einem pUPR-Plasmid, das auch die UPR-Region enthält, analysiert. Es wurde festgestellt, dass, anders als in niederen Eukaryoten wie Saccharomyces cerevisiae, die menschlichen ORC-Proteine unspezifisch an die DNA binden, wobei eine Präferenz für AT-reiche Sequenzen identifiziert werden konnte. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der ORC1-5- und ORC1-5/Cdc6-Komplex eine, vermutlich durch Orc1 und Cdc6 vermittelte, stärkere DNA-Bindung aufweist als der ORC2-5-Komplex. Teile dieses Ergebnisses stimmen mit Beobachtungen in Xenopus laevis überein .
In den folgenden Teilen der Arbeit wurde durch in vivo Studien das menschliche Replikationsprotein Cdc6 während des Zellzyklus charakterisiert und die Funktion von Cdc6 im zellfreien in vitro Replikationssystem untersucht.
Es wurde gefunden, dass Cdc6 zu gleichen Mengen während des Zellzyklus synthetisiert wird. Diese Information erhöht die wachsenden Erkenntnisse über die Expression von Cdc6 in Säugerzellen. Überraschend ist die fortlaufende und gleichbleibende Synthese von Cdc6 in der S-Phase. Die subzelluläre Verteilung von Cdc6 während des Zellzyklus wird hauptsächlich durch Phosphorylierung gesteuert, phosphoryliertes Cdc6 löst sich in der S-Phase ab und wird ins Cytoplasma transportiert. Trotz der S-Phase vermittelten Kern-Cytoplasma-Transfers bleibt immer noch ein Teil von Cdc6 Chromatin-gebunden. Ein Grund dafür ist, dass Cdc6 in hohen Mengen während der S-Phase gebildet wird. Außerdem wurde in diesem Abschnitt gezeigt, dass die Mengen an markiertem Chromatin-gebundenem Cdc6 in G1- und S-Phase ähnlich sind. Diese Ergebnisse beweisen, dass die Fraktion des alten Cdc6 während der S-Phase vom Chromatin dissoziiert, in das Cytoplasma transferiert und dann von neu synthetisiertem Cdc6 ersetzt wird. Einmal an Chromatin gebunden, verhält sich das neu markierte Cdc6 wie das alte, es dissoziiert und verschwindet aus dem Kern mit einer Halbwertszeit von < 4 h. Dieser Zyklus von Synthese, Chromatin-Bindung und Dissoziation muss mit Funktionen von Cdc6 in der Genom-Replikation zusammenhängen. Eine Funktion ist sicherlich der Zusammenbau des Prä-Replikationskomplexes, aber es müssen noch weitere Funktionen notwendig sein für die Initiation der DNA-Replikation oder den Zeitpunkt danach, wie z.B. die Aktivierung von späten Origins.

Die Daten dieser Arbeit geben zusätzlich zu schon existierenden Ergebnissen Aufschluss über Komponenten und Struktur des Prä-Replikationskomplexes und können somit als Grundlage für aufbauende Studien benutzt werden.