In dieser Arbeit wurden die immunogenen (Antikörper induzierenden) Eigenschaften von Borrelia burgdorferi s.l. und Chlamydophila pneumoniae, beides Pathogene, die in Menschen über Jahre persistieren können, wurden untersucht.
B. burgdorferi s.l. ist der Verursacher der Lyme Borreliose (LB) und Persistenz kann in Menschen zu Spätmanifestationen wie Acrodermatitis chronica atropicans, Arthritis und Neuroborreliose führen.
C. pneumoniae stellt ein weit verbreiteter Atemwegserreger dar, der zu Lungenentzündungen und Bronchitis führen kann. Infektionen wurden mit chronisch, degenerativen Erkrankungen wie Atherosklerose, Asthma, Multiple Sklerose und Alzheimer assoziiert. Einige Untersuchungen deuten vor allem auf eine Rolle von
C. pneumoniae in der Atheroskleroseentwicklung hin, aber dies wird kontrovers diskutiert.
Die Diagnose einer Infektion mit diesen Bakterien wird hauptsächlich mittels serodiagnostischen Tests erstellt, welche weit davon entfernt sind zufrieden stellend zu sein. Die Diagnose könnte durch die Verwendung passender rekombinanter Antigene anstelle von reinen Bakterien-Extrakt verbessert werden. Daher war die Hauptfragestellung die Identifizierung von antigenen Strukturen von B. burgdorferi s.l. und C. pneumoniae mittels Affinitätsselektion einer genomischen Phagen Oberflächen Bibliothek gegen Seren von infizierten Patienten.

1. Zufällige genomische Bibliotheken wurden für beide Bakterien hergestellt. Die Diversität der Bibliotheken variierte zwischen 3,3x 106 für B. afzelli, 8,2x 106 für C. pneumonaie und 7,5x 107 für B. burgdorferi s.s und B. garinii, und war umfassend genug alle Gene die im bakteriellen Genom kodiert sind zu repräsentieren.

2. Das Protokoll der Affinitätsselektion und der Phagenvektor wurden verändert, was eine Anreicherung von Phagen gegen IgG Antikörpern von infizierten Patienten erlaubte. Die erfolgreiche Anreicherung wurde zum Beispiel in einem fünffachen Anstieg in der Anzahl eluierter Phagen im Vergleich zur letzten Waschfraktion für die Borrelien-Bibliothek beobachtet. Die Gesamtzahl eluierter Phagen stieg für die Chlamydien-Selektion um über 950% an.

3. Die angereicherten Phagen brachten neun Borrelien-Proteine zusammen mit dem bekannten Antigen BBK32 hervor. Für C. pneumoniae wurden 10 offene Leserahmen angereichert. Das polymorphic membrane protein 19 (pmp19) wurde als Hauptantigen identifiziert (~50% der Klone), die neun weiteren Proteine wurden mit geringerer Häufigkeit detektiert.

4. Eine Pilotuntersuchung zweier Borrelien-Proteine (ctc, flgL) zeigte für ctc im ELISA eine höhere Reaktivität mit den Seren von LB Patienten als mit Seren von sero-negativen Kontrollen. Deshalb hat das ctc Protein ein immunogenes Potential in der Borreliose.

Zusammenfassend wurde die Phagenoberflächenpräsentations-Technologie erfolgreich zum Durchsuchen bakterieller Bibliotheken gegen Patienten IgG übertragen. Einige neue immunogene Strukturen wurden identifiziert. Die erfolgreiche Anwendung wird durch die Identifizierung des bekannten Antigens BBK32, die Identifizierung von einigen Oberflächenproteinen und die Pilotuntersuchung hervorgehoben.

In einem zweiten Teil dieser Doktorarbeit wurde ein Mausinfektionsmodel für
C. pneumoniae entwickelt.

1. Mäuse wurden mit einer geringen Dosis an Chlamydien intranasal infiziert und deren Ausbreitung in verschiedenen Organen mittels einer neuen Real-Time PCR beobachtet. C. pneumonaie wurde nur in der Lunge und der BAL (Broncheo-alveolarlavage) gefunden, und zeigten eine maximale bakterielle Last am Tag der Infektion in der BAL und zwei Tage später in der Lunge. Am Tag 95 war C. pneumoniae vollständig eradiziert.

2. Der Infektionsverlauf war leicht (keine Induktion von TNFalpha und IL-6), aber IgG-Antikörper waren ab dem 18. Tag mittels eines Mikroimmunofluoreszenz-Tests feststellbar, was eine Aktivierung des Immunsystems anzeigte.

3. Die reduzierende Wirkung auf die bakterielle Last durch eine Antibiotikabehandlung wurde im Infektionsmodel gezeigt, was auf den Wert des Modells für Behandlungsstudien oder für die Testung von Arzneimittelkandidaten hinweist.

4. Es waren keine Unterschiede in der Clearence der Bakterien und der Immunantwort zwischen TLR2-/- Mäusen, TLR4 defekten Mäusen und deren entsprechenden Wildtypestämmen feststellbar.

Zusammenfassend wurde ein gut beschriebenes und kontrolliertes Infektionsmodell entwickelt welches weitgehend die Klinik der menschlichen Infektion wiederspiegelt. Das Modell erscheint passend für die Testung von Impfstrategien, zum Beispiel mit den identifizierten Proteinen aus den Phagenbibliothekanwendungen, zu sein.

Abschließend gesehen war die Anwendung der Phage Display Technologie ein erfolgreiches Instrument zur Identifizierung neuer Antigene aus dem Genom von Borrelien und Chlamydien. Zusammen mit einem ausreichend gut charakterisierten Tiermodell stellt es auch für andere Infektionskrankheiten, denen es an einer geeigneten Serodiagnose oder an Impfstoffen mangelt, ein viel versprechender Ansatz dar.

In this study immunogenic (antibody-inducing) properties of Borrelia burgdorferi s.l. and C. pneumoniae, pathogens that can persist in human beings over years, have been investigated.
B. burgdorferi s.l. is the causative agent of Lyme Borreliosis and persistence in humans can lead to late-stage manifestations such as Acrodermatitis chronica atropicans, arthritis and neuroborreliosis.
C. pneumoniae represents a common respiratory pathogen leading to pneumonia and bronchitis. Infections have been associated with chronic and degenerative diseases including atherosclerosis, asthma, multiple sclerosis and Alzheimer's. Studies point especially to a role of C. pneumoniae in the development of atherosclerosis, but this is still controversially discussed.
The main diagnostic tool for infections with these bacteria is serodiagnosis, which is far from satisfactory. The diagnosis could be improved by the use of relevant recombinant antigens instead of crude bacterial extracts. Therefore, the main objective of this study was the identification of antigenic structures of B. burgdorferi s.l. and C. pneumoniae by affinity selection of genomic phage surface libraries with sera of infected persons.

1. genome libraries were generated for both bacteria. Diversity of the libraries varied between 3.3x 106 for B. afzelii, 8.2x 106 for C. pneumoniae and 7.5x 107 for B. burgdorferi s.s. and B. garinii, and was high enough to represent all genes encoded in the bacterial genome.

2. The affinity selection protocols and the phage vector were modified, allowing the enrichment of phage with IgG antibodies of infected persons. The successful enrichment was observed for example in a five-fold increase in eluted phage compared to the last wash fraction for the Borrelia libraries. The total number of eluted phage increased over 950% for the Chlamydophila selection.

3. The enriched phage for Borrelia revealed nine proteins along with the known antigen BBK32. For C. pneumoniae ten open reading frames were enriched. Here the polymorphic membrane protein 19 (pmp19) was the major antigen identified (~50% of clones), the nine other proteins were detected with lower frequencies.

4. A pilot evaluation of two Borrelia proteins (ctc, flgL) showed higher reactivity of ctc with sera from LB patients in ELISA than with sera from seronegative controls. Hence, the ctc protein has an immunogenic potential in Lyme Borreliosis.

In summary, the phage surface display technique was successfully applied to screen bacterial libraries against patient IgGs. Several novel immunogenic structures were identified. The successful application is emphasized by the identification of the known antigen BBK32, the identification of several surface located proteins and the pilot evaluation.

In a second part of the thesis a murine C. pneumoniae infection model was established.

1. Mice were infected intranasally with a low dose of Chlamydophila and their spreading to different organs was monitored with a novel real-time PCR. C. pneumoniae was only detectable in lung und BAL, with a maximal bacterial load in the BAL on the day of infection and in the lung tissue two days later. By day 95, C. pneumoniae were completely eradicated.

2. The course of infection was mild (no induction of TNFalpha and IL-6), but IgG became detectable on day 18 by a micro immunofluorescence test (MIF) indicating activation of the immune system.

3. The reduction in bacterial burden after antibiotic treatment in the infection model was shown, indicating the value of the model for treatment studies or for testing of drugs under development.

4. No differences in clearance of bacteria and serological response were observed between TLR2-/- mice, TLR4-deficient mice and their respective wild-type controls.

In summary, a characterized and monitored murine infection model was established, which appears to reflect largely the clinic of the human infection. The model might be suitable to test vaccination strategies, for example with the identified proteins from the phage surface display applications.

Taken together, the application of phage display technology was a successful tool for the identification of new antigens from the genomes of Borrelia and Chlamydophila. Together with sufficiently characterized animal models this represents a promising approach also for other infectious diseases that lack adequate serodiagnosis or vaccines.