Biochemische Studien über eukaryotische Replikations-Initiationsfaktoren

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Datum
2004
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Schaarschmidt, Daniel
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Biochemical studies on eucaryotic replication initiation factors
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Dissertation
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Zusammenfassung

In this work I have investigated the molecular mechanisms of the initiation of DNA-replication by in vivo and in vitro studies.
In the first part of this work I could show that human MCM proteins appear to assemble in vivo around bound ORC proteins. I investigated the loading of the MCM proteins by a procedure that involved in vivo formaldehyde crosslinking and chomatin immunoprecipitation (ChIP). MCM binding sites were detected close to established ORC binding sites and start sites of replication in the upstream promoter regions of two human genes. I showed that MCM-specific antibodies preferentially precipitate these origin-containing sequences from G1 phase cells, but not from S phase cells where MCM proteins appear to be distributed over the entire chromatin sections investigated.
The results from the second part of this work showed that the plasmid pEPI-1 replicates as an episomal element in cultured CHO or HeLa cells and is replicated in an once-per-cell-cycle manner early in S phase. 5-10 copies per cell are stably maintained for more than 100 generations in the absence of selection pressure and in the absence of virally encoded transactivating factors. Chromatin immunoprecipitations and quantitative PCR analysis revealed that, in G1 phase cells, Orc1 and Orc2, as well as Mcm3, another component of the pre-replication complex, are bound to multiple sites on the plasmid. These binding sites are functional because they show the S-phase-dependent dissociation of Orc1 and Mcm3 known to be characteristic for pre-replication complexes in mammalian cells. In addition, we identified replicative nascent strands and showed that they correspond to many plasmid DNA regions. This work has implications for current models of replication origins in mammalian systems. It indicates that specific DNA sequences are not required for the chromatin-binding of ORC in vivo. The conclusion is that epigenetic mechanisms determine the sites where mammalian DNA replication is initiated.
In the third part of this work I developed and characterized a cell-free in vitro DNA-replication assay from human cells. I could show that the depletion of human ORC or MCM proteins leads to an inhibition of the in vitro replication of DNA.
The expression of recombinant human MCM-proteins was the aim of the last part of this work. Using the baculovirus expression system I could isolate a MCM4/6/7 complex which was lacking any ATPase- or helicase-activity. This complex showed also no DNA-binding activity. Studying the biochemistry of a hexameric MCM2-7 complex I detected binding activity to double stranded DNA.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

In der vorliegenden Dissertation wurden eine Reihe von in vivo und in vitro Studien durchgeführt, die dazu beitragen, die Mechanismen der Initiation der DNA-Replikation besser zu verstehen.
Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass humane Mcm-Proteine in vivo an zwei gut charakterisierte humane ORC-Bindestellen bzw. Startstellen der DNA-Replikation binden. In vivo Crosslinks mit anschließenden ChIP-Assays von synchron wachsenden Zellen deuteten dabei auf ein dynamisches Bindungsverhalten der Mcm-Proteine im Verlaufe des Zellzyklus hin. Mcm-Proteine wurden neben anderen Komponenten des Prä-Replikationskomplexes in der G1-Phase an den Origin-Bereichen nachgewiesen. Nach erfolgter Initiation lösen sich die Mcm-Proteine vom Origin ab und scheinen mit der Replikationsgabel mitzuwandern.
Die Ergebnisse, die im zweiten Teil beschrieben wurden, haben gezeigt, dass das Plasmid pEPI-1 in CHO- und in humanen HeLa-Zellen extrachromosomal vorliegt, genau einmal pro Zellzyklus repliziert wird und dass die Replikation sehr früh in der S-Phase des wirtseigenen Zellzyklus erfolgt. Das episomale Replikon bleibt über mehrere Generationen ohne Selektionsdruck stabil in den Zellen vorhanden, was auf eine erfolgreiche Segregation während der Mitose zurückzuführen ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass Komponenten des Prä-Replikationskomplexes an pEPI-1 in vivo binden. Die Beobachtung, dass das Bindungsverhalten und die Zusammen-setzung der untersuchten Replikations-Initiationsfaktoren zellzyklus-abhängig sind, deutet darauf hin, dass die Prä-Replikationskomplexe an pEPI-1 funktionsfähig sind. Mcm3p und Orc1p haben sich im Zuge der S-Phase von pEPI-1 abgelöst und damit eine vergleichbare Dynamik im Bindungsverhalten gezeigt wie sie bei zellulären Prä-Replikationskomplexen beobachtet wurde. Zudem hat ein durchgeführter nascent DNA strand abundance -Assay ergeben, dass die Initiation der DNA-Replikation an mehreren Stellen des pEPI-1-Plasmides erfolgen kann. Derivate von pEPI-1, bei denen die Sequenz einer bekannten humanen ORC-Bindestelle einkloniert wurde, haben weiterhin eine gleichmäßige, über das Plasmid verteilte ORC-Bindung gezeigt. Die Schlussfolgerung aus diesen Studien ist, dass die DNA-Sequenz für die Definition einer ORC-Bindestelle bei höheren Eukaryoten eine untergeordnete Rolle spielt und dass bei Säugerzellen viel mehr epigenetische Faktoren den Ort der ORC-Bindung und damit die Startstelle der DNA-Replikation bestimmen.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Entwicklung und Charakterisierung eines zellfreien in vitro Replikationssystemes aus humanen Zellextrakten dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass eine Depletion von menschlichen Orc- oder Mcm-Proteinen zu einer vollständigen Inhibition der in vitro Replikation führt. Dies deutet darauf hin, dass Replikations-Initiationsfaktoren ein essentieller Bestandteil von diesem System sind.
Im letzten Teil dieser Arbeit ist es schließlich gelungen, menschliche Mcm-Proteine mit Hilfe des eukaryotischen Baculovirus-Expressionssystemes herzustellen und unterschiedliche MCM-Proteinkomplexe zu isolieren. Ein trimerer hMcm4/6/7p-Komplex hat jedoch entgegen einer Reihe von Veröffentlichungen weder ATPase- noch Helikase-Aktivität gezeigt. Auch konnte keine Affinität zu einzelsträngiger DNA beobachtet werden. Im Zuge der biochemischen Charakterisierung eines gereinigten hexameren hMcm2-7p-Komplexes wurde dessen Bindungsaffinität zu doppel-strängige DNA festgestellt.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Episomal, pEPI-1, MCM, ORC, replication, initiation, DNA-Replication, episomally
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690SCHAARSCHMIDT, Daniel, 2004. Biochemische Studien über eukaryotische Replikations-Initiationsfaktoren [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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June 18, 2004
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