Mitosis, the process by which identical copies of the replicated genome are distributed to newly forming daughter cells, depends upon the action of the mitotic spindle, a protein machine that uses mirotubules and microtubule-based motor proteins to assemble itself and to segregate sister chromatids. The assembly and the functions of superfamily are fundamental for the structure and function of the mitotic spindle by regulating microtubule dynamic behaviour to ensure the fast capture of chromosomes and the alignment of chromosomes at the metaphase plate.

Our studies demonstrate that the human kinesin Kif18A is a motile microtubule depolymerase essential for chromosome congression in mammalian tissue culture cells and thus identify the human kinesin Kif18A as a dual-functional kinesin. In vitro, Kif18A is a slow plus-end-directed kinesin that possesses microtubule depolymerizing activity. Notably, Kif18A depolymerizes longer microtubules more quickly than shorter ones. In vivo, Kif18A accumulates in mitosis where it localizes close to the plus ends of kinetochore microtubules. The depletion of Kif18A induces aberrantly long mitotic spindles and loss of tension across sister kinetochores, resulting in the activation of the Mad2-dependent spindle-assembly checkpoint and thus accounts for the observed prometaphase delay. Live-cell microscopy studies revealed that Kif18A-depleted cells fail to align chromosomes correctly at the metaphase plate resulting in an elongated phase of chromosome oscillations and thus in a delay of anaphase onset. Moreover, our studies indicate that key mitotic kinases are required for the observed mitosis-specific upshift in the electrophoretic mobility of Kif18A. In addition, the C-terminus of Kif18A is phosphorylated by mitotic kinases in vitro.

Serine to alanine substitutions at specific sites indicate that these sites are critical for the observed mitotic upshift. Most importantly, the identified phosphorylation sites in vitro are target sites in Kif18A in vivo. To examine the consequence of phosphorylation events of Kif18A in vivo, stable cellines expressing either non-phosphorylatable or phosphorylationmimicking Kif18A versions were generated. Our studies focused thereby on potential phosphorylation sites identified in vitro. Moreover, these sites in Kif18A were conserved among different species. The ability of the different Kif18A variants to complement the loss of endogenous Kif18A was assayed by transfecting HeLa cells with siRNAs targeting the ORF region of endogenous Kif18A transcripts and by tetracycline induced expression of siRNA resistant GFP-Kif18AFL constructs. These studies revealed that HeLa cells expressing, instead of the endogenous protein, Kif18A with a mutation at the identified phosphorylation sites, entered anaphase after a slight delay compared to cells expressing GFP-Kif18AWT and were characterized by defects in chromosome oscillations.

Bei der Mitose handelt es ich um einen zellulären Prozeß, bei dem die replizierten Kopien des Genoms auf die neu entstehenden Tochterzellen aufgeteilt werden. Um diese Aufgabe erfüllen zu können, besitzen die Zellen eine spezialisierte, auf Mikrotubuli und Mikrotubuli-assoziierte Proteine basierende zelluläre Struktur, die mitotische Spindel. Der Aufbau und die Funktion des Spindelapparats werden durch das genau abgestimmte Zusammenspiel von dynamischen Mikrotubuli und präzise regulierten Motorproteinen bestimmt. Mitglider der Kinesin Superfamilie sind essentiell für die Struktur und Funktion der mitotischen Spindel indem sie das dynamische Verhalten der Mikrotubuli regulieren. Somit kommt ihnen eine Schlüsselfunktion bei der schnellen Anheftung der Chromosomen an die Spindelmikrotubuli und deren Anordnung an die Metaphasen Platte zu.

Unsere Daten zeigen, dass Kif18A eine motile Mikrotubulidepolymerase ist, die eine wichtige Funktion bei der Anordnung der Chromosomen in Säugetierzellen ausübt und somit Kif18A als ein einzigartiges Motorprotein mit einer dualen Funktion identifizieren. Die in vitro Untersuchungen ergaben, dass Kif18A eine langsame, zum Plus-Ende der Mikrotubuli gerichtete Motoraktivität mit einer Depolymeraseaktivität vereinigt. Diese Untersuchungen ergaben auch, dass Kif18A eine längenabhängige Mikrotubulidepolymerase ist, die längere Mikrotubuli schneller depolymerisiert, als kürzere. In vivo akkumuliert Kif18A während der Metaphase an den Plus-Enden der Kinetochormikrotubuli. Die Depletion von Kif18A führt zu längeren mitotischen Spindeln und zu erniedrigten Interkinetochordistanzen, die zur Aktivierung des Mad2 abhängigen Spindelkontrollpunktes führen. Echtzeitaufnahmen ergaben, dass die Chromosomen in Kif18A depletierten Zellen sich durch kontinuierliche oszillierende Bewegungen auszeichnen, die eine geordnetes Anordnen der Chromosomen in der Äquatorialebene verhindern, und schließlich in einer zeitlichen Verzögerung des Beginns der Anaphase resultieren. Darüberhinaus zeigen unsere Untersuchungen, dass Aktivitäten von mitotischen Kinasen, die spezifisch in der Mitose beobachtete langsamere elektrophoretische Wanderungsgeschwindikeit von Kif18A verursachen. In vitro Kinase Untersuchungen zeigen, dass der C-terminus von Kif18A ein Substrat von mitotischen Kinasen ist. Um die physiologische Bedeutung dieser Phosphorylierungen aufzuklären, wurden stabile Zellinien hergestellt, die nicht-phosphorylierbare (Ser/Thr nach Ala) oder so genannte phosphorylierungsimitierende (Ser/Thr nach Asp/Glu) Mutanten von Kif18A exprimieren. Der Fokus lag hierbei auf potentiellen Phosphorylierungsstellen, die den Konsensus-Phosphorylierungssequenz von mitotischen Kinasen entsprachen und in Kif18A aus den verschiedenen Spezies konserviert waren. Die Fähigkeit der einzelnen Kif18A Varianten, den Verlust des endogenen Proteins zu komplementieren, wurde untersucht, indem das endogene Kif18A mittels der RNA Interferenz Technik depletiert wurde und die Expression der Kif18A Varianten durch Tetrazyklin induziert wurde. Diese Studien ergaben, dass Zellen, welche anstelle des endogenen Proteins, Kif18A mit einer Mutation an der potentiellen Phosphorylierungsstellen exprimieren länger für den Eintritt in die Anaphase benötigen.

Unsere Studien zeigen auch, dass Zellen, die Kif18A mit Mutationen an Phosphorylierungsstellen exprimieren, sich durch Defekte in der Chromosomen Oszillation auszeichnen.