In contrast to fish, mammals are unable to regenerate lesioned fiber tracts in the central nervous system (CNS). Two major factors are postulated to be responsible: intrinsic neuronal properties and the glial cell environment. Upon injury several types of molecules produced by glial cells elicit inhibitory effect on neurite outgrowth. One of these, oligodendrocyte-derived RTN4/Nogo was demonstrated to act as a potent inhibitor of axon regeneration and to block neurite extension via two domains: the Nogo-A-specific region and Nogo-66 located in N- and C-terminal parts of the protein, respectively.

The present work focuses on the evolution of RTN4/Nogo and its inhibitory domains in chordates as well as their functional characterization in fish. In order to comprehend the origin of the Nogo-A-specific region (NSR) all available genomes of chordates were analyzed. Our data indicate that the common ancestor of fish and tetrapods had an NSR-coding rtn4 gene, which underwent duplication and divergent evolution in bony fish. Thus, in the zebrafish, the NSR was lost in rtn4 but retained in its duplicate rtn6, whereas in the pufferfish, the NSR was retained in rtn4 and the entire rtn6 gene was deleted. Distant homology screening in combination with protein architecture analysis reveals the relation of this region to CSPG neurocan on the levels of domain organization and sequence similarity, such as shared presence of the putative integrin-binding motifs. Therefore, Nogo-A most likely originated from the insertion of a neurocan DNA sequence into an ancestral rtn4 gene. Notably, the proposed timing of this event coincides with the acquisition of jaws and myelin by vertebrates. These results not only shed light on the evolution of Nogo-A, but may facilitate the identification of its molecular receptor(s).
Although the NSRs in fish and mammals share only 18% identity on the primary structure level, zebrafish Nogo-66 is 66% identical and more than 80% similar to its rat homologue. This notion raises the question whether the fish peptide is able to exert neurite outgrowth inhibition. Surprisingly, in the outgrowth, collapse and contact assays zebrafish Nogo-66 appeared to be growth-permissive for fish and mammalian neurons, quite in contrast to its rat Nogo-66 homologue which inhibits growth. Upon binding to their common receptor NgR1, the rat peptide in contrast to zebrafish Nogo-66 elicits phosphorylation of the downstream effector cofilin which leads to actin filament disassembly. These data are in agreement with the apparent absence of neurite outgrowth inhibitors in fish CNS. However, it is not clear how so similar peptides can exert different responses. Thus, we have analyzed Nogo-66/NgR1 interaction combining coevolutionary and structure modeling approaches. Our results demonstrate that both proteins are already present in cephalochordates but began to coevolve only after fish-tetrapod split. Based on conservation analysis of primary and tertiary structures of these molecules and on published functional data we were able to reconstruct the receptor-ligand complex and model Nogo-66/NgR1 interactions in mammals and fish. The obtained results are in agreement with the previous notion that Nogo-66/NgR1-induced signal transduction becomes inhibitory during/after the fish-tetrapod transition.

These extensive analyses of evolution of both inhibitory domains of RTN4/Nogo may help to understand why the ability to regenerate lesioned axons in the CNS became restricted during vertebrate evolution. Moreover, the combination of structural and functional approaches can provide the necessary information which molecular changes during RTN4 evolution are responsible for the acquisition of its inhibitory properties.

Im Gegensatz zu Fischen sind Säugetiere nicht in der Lage geschädigte Nervenbahnen des Zentralnervensystems (ZNS) zu regenerieren. Zwei Hauptfaktoren werden hierfür als Ursachen postuliert: Intrinsische neuronale Eigenschaften und das biochemische Umfeld der Gliazellen. Diese produzieren nach einer Nervenverletzung verschiedenste Klassen von Molekülen, die eine inhibitorische Wirkung auf das Neuritenwachstum haben. Ein solches Molekül ist das von Oligodendrozyten produzierte RTN4/Nogo. Es konnte gezeigt werden, dass es sich hierbei um einen wirkungsvollen Inhibitor der Axonregeneration handelt, der außerdem in der Lage ist die Verlängerung von Neuriten zu blockieren. Zwei Domänen spielen dabei eine besondere Rolle: Die Nogo-A-spezifische Region (NSR) und Nogo-66, welches jeweils am N- und C-Terminus des Proteins gelegen ist.

Diese Arbeit konzentriert sich im Besonderen auf die evolutive Entwicklung von RTN4/Nogo und seiner inhibitorischen Domänen in Chordaten, sowie ihrer funktionellen Charakterisierung in Fischen. Um den Ursprung der Nogo-A-spezifischen Region nachzuvollziehen, wurden alle zugänglichen Chordatengenome analysiert. Unsere Daten deuten darauf hin, dass der gemeinsame Vorfahre von Fischen und Tetrapoden bereits ein NSR-kodierendes Gen hatte, welches in Knochenfischen verdoppelt wurde und eine divergente Evolution durchlaufen hat.

So ist zu erklären, dass in Zebrafischen die NSR in rtn4 fehlt, aber in rtn6, dem Duplicat von rtn4, erhalten geblieben ist. Im Tetraodon und Fugu hingegen ist die NSR in rtn4 erhalten geblieben, und das gesamte rtn6 Gen deletiert. Eine Analyse der Homologien, zusammen mit Untersuchungen der Proteinarchitektur führte zu der Entdeckung, dass diese Region mit Chondroitinsulfat-Proteoglycan (CSPG), speziell Neurocan verwandt ist. Dies ergibt sich sowohl aus einer ähnlicher Domänenorganisation als auch aus sequenzieller Ähnlichkeit, wie zum Beispiel das Vorhandensein eines gemeinsamen Integrin Bindemotivs. Daraus folgt, dass Nogo-A wahrscheinlich aus der Insertion einer Neurocan DNA Sequenz in das ursprüngliche rtn4 Gen entstanden ist. Zeitlich korreliert dies mit der Entwicklung von Kiefer und Myelin in Vertebraten. Diese Ergebnisse erklären nicht nur die Evolution von Nogo-A, sondern könnten Hinweise für die Identifikation des noch unbekannten NSR Rezeptors liefern.

Obwohl die Sequenzen der NSR in Fischen und Mammaliern nur zu 18% gleich sind, ist Nogo-66 von Zebrafischen zu 66% identisch und zu 80% ähnlich zu dessen Homolog in der Ratte. Dadurch ergab sich die Frage, ob das Fischpeptid in der Lage ist das Wachstum von Neuriten zu inhibieren. Überraschenderweise haben Experimente zu Wachstum, Zerfall und Kontakt von Neuriten gezeigt, dass das Zebrafisch Nogo-66 im Gegensatz zu seinem Rattenhomolog nicht wachstumsinhibierend wirkt.

Im Gegensatz zum Fisch-Nogo-66, führt die Bindung des Rattenpeptids an den gemeinsamen Rezeptor NgR1 zu einer Phosphorylierung des Effektorproteins Cofilin, was dann zu einer Aktindepolymerisation führt. Diese Daten stimmen mit der Tatsache überein, dass Inhibitoren des Neuritenwachsums im Sehsystem der Fische fehlen. Unklar bleibt, wie zwei sehr ähnliche Peptide zwei so unterschiedliche Reaktionen hervorrufen können. Daher haben wir die Interaktion von Nogo-66 mit NgR1 mittels Co-evolutions- und Strukturmodellierung untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass beide Proteine bereits in Cephalochordaten vorhanden sind, jedoch die Co-Evolution erst nach der Abspaltung von Fischen und Tetrapoden begann. Durch die Analyse der Primär- und Tertiärstrukturen von Nogo-66 und NgR1 und publizierten Daten zu ihrer Funktion, konnten wir den Rezeptor-Liganden-Komplex rekonstruieren und ein Modell für die Nogo-66/NgR1-Interaktion in Säugertieren und Fischen modellieren. Die Ergebnisse lassen sich mit der oben genannten Beobachtung vereinen, dass die Nogo-66/NgR1-induzierte Signaltransduktion erst während/nach der Abspaltung von Fischen und Tetrapoden inhibitorisch wurde.

Diese weitreichenden Analysen zur Evolution der beiden inhibitorischen Domänen von RTN4/Nogo könnten helfen zu verstehen, warum die Fähigkeit verletzte Axone zu regenerieren im Laufe der Vertebratenevolution verloren ging. Des Weiteren können die Untersuchungen zur Struktur und Funktion wichtige Hinweise dazu liefern, welche molekularen Veränderungen in RNT4 im Laufe der Evolution für den Erwerb der inhibitorischen Eigenschaften verantwortlich waren.