Biochemical and X-ray crystallographic studies on the energy transducing protein TonB and the TonB-dependent siderophore receptor FhuA from Escherichia coli

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2004
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Ködding, Jiri
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Biochemische und röntgenkristallographische Untersuchungen an dem Energieübertragungsprotein TonB und dem TonB-abhängigen Siderophore Rezeptor FhuA von Escherichia coli
Forschungsvorhaben
Organisationseinheiten
Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
Published
Erschienen in
Zusammenfassung

Die Zellwand gram negativer Bakterien beinhaltet viele Proteine die für den Transport lebenswichtiger Substanzen verantwortlich sind. Vor allem die Äußere der beiden Lipidmembranen erfüllt eine wichtige Schutzfunktion, die besondere Anforderungen an die Transportsysteme der äußeren Membran stellt. Die direkte Aufnahme von Eisen stellt ein besonderes Problem dar, da die Konzentration an freien Eisenionen in wässriger Lösung sehr gering ist. Bakterien haben dieses Problem durch spezifische Transportwege für eine ganze Anzahl von chemisch verschiedenen Siderophoren gelöst. Siderophore sind Moleküle von etwa 600 Da, die Eisenionen aus der Umgebung der Zelle komplexieren und zum Teil von den Bakterien selbst synthetisiert und sekretiert werden. Eines dieser Siderophore ist Ferrichrome das pilzlichen Ursprungs ist und in Escherichia coli durch das Transportprotein FhuA (ferric hydroxamate uptake system) über die äußere Membran ins Periplasma aufgenommen wird. Einige Phagen wie T1, T5, 80 und UC-1 nutzen FhuA als Bindeprotein an E. coli. Auf der anderen Seite stellt FhuA auch einen wichtigen Aufnahmeweg für einige Antibiotika dar, wie für das chemisch dem Ferrichrom verwandte Albomyzin oder für das strukturell ganz anders aussehende Rifamycin Derivat CGP 4832. Die Energie, die für diese spezifische Aufnahme durch FhuA gebraucht wird, stammt von der chemischen Potentialdifferenz an der inneren Bakterienmembran, hervorgerufen durch einen H+-Konzentrationsradienten. Die Übertragung der Energie von der inneren Membran auf FhuA erfolgt durch den Proteinkomplex ExbB/ExbD/TonB. Alle drei Proteine sind in der inneren Membran verankert, wobei der größte Teil von TonB ins Periplasma ragt und mit seiner C-terminalen Domaine den eigentlichen Kontakt zu FhuA herstellt. Da TonB eine große Anzahl homologer Außenmembran-Transporter mit der nötigen Energie versorgt, wird diese Klasse von Proteinen, im Gegensatz zu den ABC-Transportern, als TonB-abhängige Transporter bezeichnet.
Die dreidimensionalen Röntgenstrukturen von einigen TonB-abhängigen Transportproteinen sind mittlerweile bekannt. Für die vorliegende Arbeit ist die Struktur von FhuA (Ferguson et al., 1998, Science, 282, 2215) von besonderer Bedeutung. Ebenfalls bekannt sind einige Strukturen von FhuA mit verschiedenen Liganden wie Ferrichrome, Phenylferrichrome, Albomyzin und Rifamyzin CGP 4832. Die Strukturlösung des FhuA-CGP 4832 Komplexes ist Teil der vorliegenden Arbeit.
TonB, das aus 239 Aminosäuren besteht, wurde erstmals nur als Fragment der letzten 85 C-terminalen Aminosäuren kristallisiert (Chang et al., 2001, JBC, 276, 27535). Dieses TonB-85 Fragment zeigt ein Homodimer, dessen funktionelle Rolle im Prozess der Energieübertragung unbekannt blieb.
Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedlich lange C-terminale Fragmente von TonB aus E. coli überexprimiert und gereinigt, bestehend aus 77, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 106, 116 und 126 Aminosäuren. Die Kristallisation und Strukturanalyse konnte für zwei TonB Fragmente erfolgreich durchgeführt werden: TonB-77 zeigt eine Dimerenstruktur, identisch mit der von TonB-85. TonB-92 bildet dagegen eine signifikant andere Struktur. Diese unterschiedlichen Strukturen sind im Einklang mit dem Verhalten dieser Fragmente in Lösung: Die kürzeren Fragmente liegen als Dimere und die längeren Fragmente als Monomere vor. Für ein weiteres Verständnis der FhuA-TonB Wechselwirkung wurde die Fähigkeit der TonB Fragmente untersucht, in vitro an FhuA zu binden. Es stellte sich heraus, daß die gleichen Fragmente, die in der Lage sind FhuA zu binden, auch die Ferrichromaufnahme in vivo blockieren und die Zellen vor dem Angriff durch Bakteriophagen phi80 schützen.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

A large number of proteins are involved in the transport of essential compounds across the cell wall of gram-negative bacteria. The very low concentration of free iron ions in aqueous solutions makes the use of specific uptake systems necessary. One transport system of the outer membrane of Escherichia coli is the protein FhuA (uptake of ferric hydroxamate). FhuA is a specific transporter for the iron chelating molecule ferrichrome. Several low molecular weight compounds called siderophores that scavange iron from the external environment have already been reported in the literature. The 3D-structures of both FhuA alone and in complex with its siderophore were solved by A. Ferguson in 1998 (Ferguson et al., (1998)Science, 282, 2215). FhuA also serves as the primary receptor for several antibiotics like the rifamycin derivative CGP 4832 that is structurally not related to hydroxamate type siderophores. We have solved the crystal structure of FhuA in complex with CGP 4832 (Ferguson et al., (2001) Structure 9, 707). The energy required for the transport process is provided by the proton motive force of the cytoplasmic membrane and is transmitted to FhuA by the protein TonB. TonB forms a large protein complex with ExbB and ExbD. The structure of full length TonB is not known, however, the structure of the last 86 C-terminal amino acid residues of TonB is available in the literature (Chang et al., (2001) JBC, 276, 27535). TonB 86 crystallized as an intertwined homodimer. The functional role of this dimer in the process of energy transduction remains completely unknown.
During the course of my Ph.D. thesis I purified several C-terminal fragments of TonB from E. coli consisting of 77, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 106, 116 and 126 amino acid residues, respectively, and tried to crystallize them. TonB-77 was successfully crystallized and its 3D-structure could be determined. The structure of TonB-77 presents a homodimer, very similar to the recently published TonB-86 structure (Koedding et al., (2004)JBC, 279, 9978). We were also able to crystallize TonB 92 and to collect a native X ray diffraction data-set at 1.09 Å resolution (Koedding et al., (2004)Acta D60, 1281). The selenomethionine substitution method was used to obtain the phase information needed for a successful determination of the 3D structure of TonB 92. A comparison of TonB 92 with TonB 86 shows significant differences between the two structures (Koedding et al., (2004) JBC, submitted). This finding is in agreement with my previous results concerning the behaviour of the purified TonB-fragments in solution. The shorter fragments behave dimeric, whereas the longer fragments behave monomeric in solution. For a more detailed understanding of the FhuA-TonB interaction I analysed the ability of the truncated C-terminal TonB-fragments to bind to the outer membran receptor FhuA. TonB-fragments that bind to FhuA in vitro also inhibit ferrichrome uptake via FhuA in vivo and protect cells against attack by bacteriophage phi80 (Koedding et al., (2004)JBC, 279, 9978).

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
FhuA, Siderophorerezeptor, FhuA, siderophore receptor, X-ray crystallography, TonB-dependent
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690KÖDDING, Jiri, 2004. Biochemical and X-ray crystallographic studies on the energy transducing protein TonB and the TonB-dependent siderophore receptor FhuA from Escherichia coli [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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December 15, 2004
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