Mit Hilfe von Peptiden, die auf MHC-Klasse-I Molekülen präsentiert werden, können zytotoxische T-Lymphocyten mit ihrem T-Zellrezeptor Zellen erkennen, die von Pathogenen infiziert oder zu einer Tumorzelle entartet sind. Das Proteasom, eine abundante Protease eukaryontischer Zellen, spielt dabei eine zentrale Rolle. Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Analyse verschiedener Parameter des MHC-Klasse-I Weges, wobei die Rolle der drei induzierbaren, proteolytisch aktiven Untereinheiten LMP2, LMP7 und MECL-1 im Mittelpunkt stand. Als Werkzeug, um dies zu untersuchen, wurde das gut charakterisierte Lymphozytäre Choriomeningits Virus (LCMV) verwendet. In der Vergangenheit wurden widersprüchliche Resultate erhalten, ob Ubiquitin für die Präsentation von MHC-I-Liganden benötigt wird. Um Klarheit zu schaffen, wurde in dieser Arbeit Ubiquitin und dominant negative Formen von Ubiquitin in einem Tetrazyklin-induzierbaren System exprimiert. Nach der Induktion von Ubiquitin oder mutiertem Ubiquitin wurden keine Veränderungen in der Ubiquitylierung und in der MHC-I Oberflächenexpression festgestellt. Um die Rolle von Hsp90 in der Antigenprozessierung zu analysieren, wurden Zellen mit Geldanamycin, einem Inhibitor für Hsp90, behandelt. Diese zeigten eine dosisabhängige Reduktion in der Präsentation des LCMV-spezifischen Epitopes NP118-126. Andere LCMV-spezifische Peptide waren dagegen nicht betroffen. Verschiedene Experimente zur Spezifizierung der Rolle von Hsp90 in der Prozessierung von NP118-126 schlugen fehl. Es scheint, dass der Effekt von Geldanamycin auf NP118-126 Zell- und Virus-spezifisch ist. Die Untersuchung des Einflusses von Geldanamycin auf die Präsentation von Epitopen, die am N- oder C-terminalen Ende eines stabilen Proteins exprimiert wurden, zeigte, dass Epitope unabhängig von ihrer Position verschlechtert präsentiert werden. Im Hauptteil dieser Doktorarbeit wurde die Funktion der drei induzierbaren Proteasomuntereinheiten LMP2, LMP7 und MECL-1 in der Antigenprozessierung LCMV-spezifischer Epitope untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass Interferon-γ-behandelte Zellen das LCMV-spezifische Epitop GP33-41 verbessert und das aus dem gleichen Glykoprotein stammende subdominante Epitop GP276-286 verschlechtert präsentieren. In vitro wie auch in vivo Experimente enthüllten, dass die proteasomale Prozessierung von GP276-286 besser durch das konstitutive Proteasom als durch das Immunoproteasom vollzogen werden kann. Zahlreiche Veröffentlichungen zur Unteruchung der Subdominanz von GP276-286 blieben ohne schlüssige Resultate. Die zuvor erwähnte Zerstörung von GP276-286 durch Immunoproteasome könnte der Grund dafür sein.
Der Einfluss von MECL-1 in der Antigenprozessierung wurde mit Hilfe von MECL-1 defizienten Mäusen analysiert. Die Infektion dieser Mäuse mit LCMV zeigte eine reduzierte CTL-Antwort gegen zwei verschiedene Epitope, NP205-212 und GP276-286. Die verschlechterte CTL-Antwort gegen GP276-286 in MECL-1-/- Mäusen konnte nicht mit einem Präsentationsdefekt in diesen Mäusen erklärt werden. CD8-positive Zellen in MECL-1-defizienten Milzen waren im Vergleich zu Wildtyp Mäusen um 20% reduziert. CTLs von MECL-1-defizienten Mäusen, welche das variabe Segment Vß10 in ihrem T Zellrezeptor tragen, proliferierten nicht nach einer LCMV-Infektion. Dieser Befund sowie die Tatache, dass MECL-1 in Zellen, welche die negative Selektion im Thymus vermitteln, konstitutiv exprimiert ist, deuten auf ein verändertes T-Zellrepertoire in MECL-1 defizienten Mäusen hin. Somit konnte gezeigt werden, dass MECL-1 eine wichige Komponente des MHC-I Antigenprozessierungsweg ist. Ein weiterer Faktor, der die Immundominanz einzelner Epitope bestimmt, ist die Kinetik der viralen Proteinexpression. Es wurde gezeigt, dass eine geringe LCMV-Dosis zu einer Dominanz von NP-spezifischen CTLs führt, wohingegen GP-spezifische CTLs nach einer hohen Virus-Dosis dominieren. Die Relevanz von Immunoproteasomen wurde mit Hilfe von Cytomegaloviren (MCMV und HCMV), welche in ihrem Genom zahlreiche Proteine kodieren, die dem Virus helfen, dem Immunsystem zu enkommen, untermauert. Es konnte in vitro gezeigt werden, dass der Einbau von Immunoproteasomuntereinheiten in MCMV- und HCMV-infizierten Fibroblasten stark vermindert ist. Eine Deletion im Gen M27 von MCMV, welches einen Inhibitor für STAT2 kodiert und somit den IFN-γ Rezeptor Signalweg hemmt, hatte zur Folge, dass die Transkription und Proteinexpression der induzierbaren Proteasomeuntereinheiten wieder normal funktionierten. Das ungewöhnlich lange Signalpeptid des LCMV-Glykoproteins (GP) wurde in transfizierten und LCMV-infizierten Zellen untersucht. Dabei wurde gefunden, dass das Signalpeptid von GP langlebig ist und in Viruspartikeln akkumuliert. Diese Besonderheiten weisen darauf hin, dass das Signalpeptid nicht nur den Glykoproteinvorläufer in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums führt, sondern auch eine zusätzliche bis jetzt unbekannte Funktion im Lebenszyklus des LCMV hat.

The class I pathway allows the immunosurveillance of proteins, which are synthesized within virtually all types of cells. Proteasomes are highly abundant in eukaryotic cells and play a major role in antigen processing. The aim of this study was to analyse different parameters in the MHC-I antigen processing pathway, focused on the role of the three proteasome inducible immune subunits LMP2, LMP7, and MECL-1. As a tool to address the topics of these thesis the well-characterised lymphocytic choriomeningitis virus model was chosen. A general introduction to the topics addressed in the chapters (2-9) was described in chapter 1, focused on proteasomal degradation. Chapter 2 addressed the role of ubiquitylation in antigen processing. Ubiquitin and dominant negative mutant forms of ubiquitin were expressed in a tetracycline inducible manner to investigate whether ubiquitin is required for the presentation of ligands for MHC-I. No change in total ubiquitylation and MHC-I surface expression was observed after induction of ubiquitin or its mutant forms. In chapter 3 the role of Hsp90 in the processing of LCMV derived epitopes was investigated. Treatment of LCMV infected cells with geldanamycin, an inhibitor of Hsp90, led to a dose dependent reduction in presentation of the LCMV-derived epitope NP118, but other LCMV-derived epitopes were not affected. Different experiments to assign the role of Hsp90 in processing of NP118 failed. The dependency of NP118 on Hsp90 seems to be cell and virus specific. Analysis whether an epitope is differently affected by geldanamycin when expressed at the N-terminus compared to the C-terminus within a stable protein, revealed that both are reduced independently of their site of expression. The main part of these thesis, Chapter 4 and 5, described the role of LMP2, LMP7 and MECL-1 in the processing of LCMV-derived epitopes. Chapter 4 analysed the proteasomal processing of GP276-286, a subdominant epitope in LCMV-WE infected C57BL/6 mice. The treatment of cells with IFN-γ enhanced the presentation of GP33 41, whereas presentation of the GP276 286 epitope from the same glycoprotein was markedly reduced. Different read-out systems proved that GP276-286 is made more efficiently by constitutive proteasomes compared to immunoproteasomes. In chapter 5 the contribution of MECL-1 in antigen processing was analysed with the help of MECL-1 gene targeted mice. Infection of these mice with LCMV-WE markedly reduced the intensity of the CTL response to two different epitopes, NP205-212 and GP276-286. The reduced CTL response to GP276-286 in MECL-1-/- mice could not be assigned to a defect in presentation of this epitope. Staining of CD8 in splenocytes showed that MECL-1 deficient mice have a 20% reduction of CD8 positive cells compared to wildtype mice. MECL-1-/--derived CTLs using the Vß10 variable segment for their T cell receptors, the preferred Vß-chain of GP276-specific CTLs, didn t proliferate after LCMV infection. Therefore and as MECL-1 is constitutively expressed in cells responsible for negative selection in the thymus one can assume that MECL-1 gene targeted mice have an altered CTL-repertoire. Taken together, it is demonstrated that MECL-1 is an important component in the MHC-I antigen processing pathway. Another factor that determines immunodominance is the kinetic of viral protein expression (chapter 6). It was reported that a small load of LCMV led to immunodominance of NP-CTL, whereas a large viral load resulted in dominance of GP-CTL. Chapter 7 described that the incorporation of immunoproteasome subunits was prevented in MCMV infected, as well as HCMV-infected, fibroblasts in vitro. Quantitative assessment of LMP2, MECL-1, and LMP7 transcripts revealed that the inhibition of immunoproteasome formation occurred at a pretranscriptional level. Remarkably, a targeted deletion of the MCMV gene M27, encoding an inhibitor of STAT2 that disrupts IFN-γ receptor signaling, largely restored transcription and protein expression of immunoproteasome subunits in infected cells. In chapter 8 we have investigated the cleavage and fate of the unusually long LCMV-glycoprotein (GP) signal peptide (SP) in transfected and LCMV-infected cells. Thereby we found that the cleaved signal peptide is rather long-lived and accumulates in virus particles. These unusual features of the cleaved SP suggest that it not only targets the nascent glycoprotein precursor (pGP-C) to the endoplasmic reticulum membrane but also has additional so far unknown functions in lymphocytic choriomeningitis virus life cycle. Finally, the results from chapter 2 to 8 are discussed in chapter 9. To obtain a more profound overview of the results from chapter 2 to 8, I recommend reading the discussions at the end of each chapter. The reference list in chapter 10 is linked to chapter 1 to 9.